盘龙七片调控Toll样受体4-骨髓样分化因子88-核因子-κB通路保护佐剂性关节炎大鼠滑膜组织

林朋朝，周晓彬，高伟静，姬艳林，冯建书，李静

作者单位：1石家庄市第三医院创伤三科，河北 石家庄050000；2河北省老年病医院护理部，河北 石家庄050000

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）作为一种免疫性全身性疾病，其病理基础为滑膜炎，随着疾病的进展会引起关节畸形进而致残。目前RA的具体发病机制仍未阐明，但相关研究证实Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）-骨髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）-核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信号通路在RA的发展进程中发挥着重要的作用，TLR4是最早发现的Toll蛋白受体家族成员，能够识别抗原分子从而介导机体的固有免疫及获得性免疫来参与多种疾病的发生，其被激活后会诱导下游MyD88大量合成，继续激活下游炎性细胞递质白细胞介素-1（IL-1）受体，并最终激活NF-κB进入细胞核内，调控炎症反应的发生。RA属于中医学中的“痹症”范畴，中医认为痹症是由风寒湿邪所致，应当以祛风除湿散寒为主治。盘龙七片是中医骨伤科专家王家成先生所献秘方，主要发挥补血活血、行气止痛、祛风散寒、除湿补肝肾强筋骨等作用。目前研究表明盘龙七片治疗RA效果良好，但其具体的作用机制尚未有研究报道，本次研究于2018年5月至2019年6月通过建立RA模型大鼠后，给予不同剂量盘龙七片处理，来观察其对TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的影响，旨在为盘龙七片治疗RA的具体作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源

8周龄清洁级雄性SD大鼠50只，体质量范围为160～200 g，购于中国食品药品检定研究院［SCXK（京）2014-0013］，饲养于中国检验检疫科学研究院屏障环境动物房［SYXK（京）2014-0033］，光照12 h/黑暗12 h，室温（25±1）℃，相对湿度50%～65%，全天自由饮水，常规饲料饲养。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 主要试剂及仪器

盘龙七片（陕西盘龙药业集团股份有限公司，批号Z61020050）；弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，批号068K8761）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1酶联免疫试剂盒（上海恒斐生物科技有 限 公 司，批 号20160128、20151210）；TLR4、MyD88、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF-6）、β肌动蛋白（β-actin）引物均由上海生工合成；兔抗大鼠NF-κB p65、p-p65、β-actin抗体（美国Abcam公司购买）；Revertaid First Strand cDNA Kit试剂盒（美国Thermo公司，批号00145205）；PCR仪（PIKOREAL 96型）由美国Thermo公司提供；酶标分析仪（RI-6000型）由美国雷杜公司提供；台式离心机（TDL-4型）由上海安亭科学仪器厂提供；凝胶自动成像仪由瑞典Pharmacia公司提供；光学显微镜（BX 51型）由日本Olympus公司提供。

1.3 实验动物分组及模型制备处理

将50只SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、低、中、高盘龙七片组，每组10只，除正常组外，其余组大鼠均放置在特制的装置中，保持装置内温度为（4±2）℃，风扇风力4级，湿度保持在85%～90%，连续饲养20 d后，在每组大鼠右后足垫部位注射0.15 mL的弗氏完全佐剂，注射24 h后大鼠右足踝部出现急性炎性肿胀，48 h后注射侧及非注射侧前肢关节均出现肿胀，表明造模成功，正常组大鼠在室温18～20℃条件下正常饲养。造模成功后3 d开始，低、中、高盘龙七片组大鼠灌胃给予150 mg/kg、300 mg/kg、600 mg/kg剂量的盘龙七片溶液，1次/天，连续15 d。

1.4 血液样本及滑膜组织样本收集

末次处理后，10%水合氯醛麻醉，取腹主动脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min后收集上清，保存于-20℃待测；各组大鼠取血后处死，沿右侧膝关节上方正中行纵向切口，取出滑膜组织后，一部分4%甲醛固定用于病理学观察，一部分立刻装入RNase free的离心管中，于液氮中快速冷冻后，保存于-80℃超低温冰箱中。

1.5滑膜组织病理形态学观察

将“1.4”收集的甲醛固定好的滑膜组织经过脱钙、脱水、石蜡包埋后，连续切片成厚度为4 μm的切片，经烤片、脱蜡后进行常规苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜观察滑膜组织病理形态学变化，并拍照记录。

1.6 血清中TNF

-α

、IL

-

1水平的检测

取“1.4”中抽提的血液样本，由严格按照试剂盒说明书检测血清TNF-α、IL-1水平。

1.7 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测各组大鼠滑膜组织中细胞中TLR4、MyD88、TRAF

-

6的mRNA表达水平

取“1.4”中收取的各组大鼠滑膜组织50 g，采用Trizol试剂提取总RNA，Revertaid First Strand cDNA合 成 试 剂 盒 将RNA中反转录合成cDNA，SYBR-Green PCR Mix检测mRNA的表达水平。PCR参数设置：95°C 5 s，60°C 34 s、40个循环。所用引物（上海生工）信息如下：β-actin内 参 基 因，正 向 引 物5’-CCCATCTAATGAGGGTTACGC-3’、反向引物5’-TTTAATGTGACGCACGATTTC-3’；TLR4，正 向 引 物5’-AACATGAGTCACAACAACCTAC-3’、反 向 引 物5’-TATTCACATATACAAGCAACAG-3’；MyD88，正 向引物5’-ATTGAGAAAAGGTGTCGTCGCAT-3’、反向引 物5’-TCGCAGATAGTGATGAACCGTAGG-3’；TRAF-6，正向引物5’-CTGCTTGATGGCTTTACGGGA-3’、反 向 引 物5’-CTGGGCACTTGTGACCTGCAT-3’。用2法分析相关基因表达数据。

1.8 蛋白质印迹法检测各组滑膜组织中NF

-κ

B p65蛋白表达水平

取“1.4”中收取的各组大鼠滑膜组织100 g，加入胰蛋白酶消化后，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调整各组蛋白浓度一致后电泳、转膜、封闭，加入兔抗鼠NF-κB p65、p-p65、β-actin一抗（1∶500）4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗（1∶500）孵育2 h，显色后暗室曝光到X线片上，分析各组条带灰度值，计算目标蛋白相对内参β-actin的表达量。

2 结果

2.1 盘龙七片对RA模型大鼠滑膜组织病理结构的影响

HE染色结果显示：正常组大鼠关节滑膜细胞连续平整，结构层次清晰，无滑膜肿胀、组织坏死及炎细胞浸润情况发生，与正常组相比，模型组滑膜组织可见明显变性坏死，滑膜处可见中度充血水肿，且有大量炎细胞并伴随轻度滑膜增生，与模型组相比，不同剂量盘龙七片处理后关节变性坏死情况明显改善，滑膜组织充血水肿情况减轻，炎细胞浸润情况极大的改善，且呈浓度依赖。见图1。

2.2 盘龙七片对各组SD大鼠血清中TNF

-α

、IL

-

1

水平的影响

模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1水平显著高于对照组，不同剂量盘龙七片组大鼠血清中TNF-α、IL-1水平均低于正常组，且呈浓度依赖（

P

＜

0.05

）。见表1。

表1 各组SD大鼠血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）水平比较/（μg/L，±s）

2.3 盘龙七片对各组SD大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88、TRAF

-

6的mRNA表达水平的影响

模型组滑膜组织中TLR4、MyD88、TRAF-6的mRNA相对表达水平高于正常组，不同剂量盘龙七片组滑膜组织中TLR4、MyD88、TRAF-6的mRNA相对表达水平低于模型组，且呈浓度依赖（

P

＜0.05）。见表2。

表2 各组SD大鼠滑膜组织中Toll样受体4（TLR4）、骨髓样分化因子88（MyD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF-6）的mRNA表达水平/±s

2.4 盘龙七片对各组SD大鼠滑膜组织中NF

-κ

B p65蛋白表达水平的影响

各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65蛋白磷酸化水平整体比较，差异有统计学意义（

F

=118.023，

P

＜0.001）。其中模型组（1.37±

0.22

）高于正常组（0.21±0.06），低、中、高盘龙七片组分别为（0.95±0.14）、（0.75±0.12）、（0.33±0.09），均低于模型组，且呈浓度依赖（

P

＜0.05）。见图2。

图2 各组SD大鼠滑膜组织中NF-κB p65蛋白表达图谱

3 讨论

目前研究结果表明，RA滑膜组织处大量合成炎性细胞因子被认为是引起RA炎性反应和滑膜损伤的重要因素。TNF-α和IL-1是RA发病机制中研究最多的2个促炎性细胞因子，当机体处于RA病理状态时，机体产生的大量炎性递质会进入滑膜组织，引起滑膜组织中细胞因子平衡失调，IL-1、TNF-α等促炎性因子水平升高，抑炎性因子水平降低，诱导机体炎症反应发生。本研究结果显示，RA模型大鼠可见关节滑膜明显的变性坏死，并伴随有中度充血肿胀，同时可见大量炎性细胞浸润及滑膜轻度增生，同时腹主动脉血清中IL-1、TNF-α水平也显著升高，表明RA模型大鼠病变过程会导致细胞因子平衡失调，而IL-1、TNF-α水平升高会促进胶原酶及自由基的产生，进一步损伤关节软骨。经过盘龙七片治疗后，主动脉血清中IL-1、TNF-α水平显著降低，关节变性坏死情况明显改善，滑膜组织充血水肿情况减轻，炎细胞浸润情况极大的改善，其中盘龙七片600 mg/kg治疗缓解效果最好，这是因为盘龙七片药方中的川乌、草乌能够刺激垂体-肾上腺皮质系统，具有较强的表面麻醉作用，可用于止痛，而盘龙七具有补脾健胃、除湿利水活血功效，能够改善循环，促进炎性细胞递质的代谢，来达到抗炎镇痛、调节免疫的作用，丹参具有抗氧化、抗炎的功效，还可以抑制CRP蛋白的合成，牛膝中富含阿魏酸能够提高细胞免疫功能，秦艽主祛风除湿之效，常用于骨性关节炎、类风湿关节炎等的治疗，因此对于RA模型大鼠的滑膜组织损伤可以起到很好的保护作用。

RA作为一种系统性、自身免疫性疾病，其具体发病机制仍未研究清楚，但炎症反应过程对RA的发病及病理过程影响巨大。TLR4-MyD88-NF-κB作为研究RA最多的一个经典通路，在RA发生发展中起到重要作用，Toll样受体在很多免疫细胞上均可检测到，其中TLR4在早期和持续期RA病人的滑膜组织中表达水平显著升高，而活化的TLR4通过MyD88依赖途径首先活化IL-1受体激酶（IRAK），活化后的IRAK又会与TRAF6结合，激活TAK1激酶，继续作用于NF-κB上游抑制蛋白IκB使其降解，NF-κB被释放激活后，转位进入细胞核内，启动炎性反应免疫相关基因转录，完成炎性反应信号的传递。本研究结果中，RA模型大鼠TLR4、MyD88、TRAF6的mRNA相对表达水平及p65蛋白磷酸化均显著升高，表明RA病理变化过程与自身免疫相关，同时NF-κB信号通路激活后下游炎性相关因子表达增强，使得前炎性细胞因子水平迅速升高，这些前炎性细胞因子能通过与巨噬细胞上的特异性受体结合，诱发级联瀑布反应，诱导更多促炎性因子合成，形成级联放大反应，使关节滑膜处持续保存过度炎症反应，引起滑膜组织的持续性损伤。盘龙七片处理后，TLR4、MyD88、TRAF6的mRNA相对表达水平及p65蛋白磷酸化水平均显著降低，表明盘龙七片可能是通过抑制TLR4的识别过程，中断与MyD88的转导，抑制了NF-κB信号通路的激活，减少前炎性因子合成，缓解炎症反应，从而保护滑膜组织的破坏及异常增生。

综上所述，盘龙七片可能通过下调TLR4、MyD88、TRAF6的mRNA相对表达水平，抑制下游信号原件NF-κB激活，使得促炎性因子IL-1、TNF-α合成减少，炎症反应减轻从而保护滑膜组织。但盘龙七片是否还可以通过其他信号转导途径的多靶点促进或抑制来治疗RA还不清楚，还需要继续的深入研究。

注：箭头处为滑膜组织。