山茱萸环烯醚萜苷通过介导胞外信号调节激酶信号通路对急性脑梗死小鼠的神经保护作用

葛海，何艮霞，朱迎春，李军

作者单位：安徽省第二人民医院神经内科，安徽 合肥230041

通信作者：李军，男，副主任医师，研究方向为神经内科常见疾病内科治疗，Email：439712162＠qq.com

急性脑梗死又称为缺血性脑卒中，脑组织血氧供应不足，再加上缺血后再灌注等损伤，均会造成神经元的凋亡。胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），包括ERK1和ERK2，统称为ERK1/2，是MAPKs家族主要成员之一，参与细胞编码相关基因和细胞信号转导，与神经系统的功能有关。有研究发现，ERK1/2磷酸化在脑梗死后发挥神经保护作用。山茱萸环烯醚萜苷（Cornus iridoid glycoside，CIG）是山茱萸科植物山茱萸的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用，可促进缺血大鼠的血管生成和神经发生并减轻脑缺血大鼠的细胞凋亡和炎症，改善神经功能。有研究发现，山茱萸可能通过激活ERK途径，作用机制可能是ERK1/2磷酸化水平增高，可以调节树突蛋白合成，影响与神经突触可塑性相关的核转录因子和蛋白质翻译起始因子的磷酸化状态，提高老年性痴呆大鼠学习记忆能力；山茱萸多糖改善老年性痴呆大鼠学习记忆能力通过激活ERK途径实现。另有研究发现，山茱萸环烯醚萜总苷可抑制核因子-κB（NFκB）信号通路和ERK1/2信号通路激活，从而降低机体炎性水平，改善小鼠胰岛素敏感水平和肝损伤程度。但是CIG对缺血再灌注小鼠神经元细胞的影响及ERK1/2信号通路的调控报道较少。因此，本研究于2019年3—6月对此进行了初步研究，并探究其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

实验材料及试剂18只清洁级雄性ICR小鼠由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，周龄5～6周，体质量平均25 g，合格证号：SCXK（沪）20130024；CIG购自中国北京同仁堂（集团）有限责任公司；氯化三苯四氮唑（TTC）购自中国国药集团上海化学试剂公司；TUNEL检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；ERK1/2，B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2），Bcl-2相关X（Bax）蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）扩增序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成；实时荧光定量PCR试剂、cDNA Reverse Transcription kit、RNAiso plus（D9108A）Trizol均购自大连宝生物Takara公司；Bestar™Real time PCR Master Mix购自德国DBI公司；抗磷酸化胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）、Bcl-2、Bax抗体均购自Santa Cruz公司，ERK1/2、GAPDH抗体购自上海康成生物工程有限公司；RIPA裂解液购自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.1.2

实验仪器RM2235石蜡切片机购自Leica公司；ABI7500fast荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems公司；PCR扩增仪购自美国Life technologies公司；紫外分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司；电泳仪、转膜仪购自Bio-rad公司；酶标仪购自Thermo公司；化学发光成像系统购自GE公司；线栓购自广州佳灵公司（线栓头直径0.18 mm）；CH-2 CX31荧光倒置相差显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1

动物模型制备及分组参照文献采用大脑中动脉栓塞法（MCAO）建立小鼠急性脑梗死模型。使用异氟烷麻醉小鼠后，暴露颈外动脉、颈总动脉、颈内动脉，颈外动脉近心端结扎，颈总动脉近心端结扎，于颈总动脉远心端插入线栓，进线5 mm。根据随机数字表法将18只清洁级雄性ICR小鼠分为对照组、模型组和实验组，每组各6只。对照组小鼠不插入线栓，模型组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液，实验组小鼠腹腔注射150 mg/kgCIG，连续给药7 d，每天给药1次，7 d后再次对小鼠进行神经损伤评分。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2.2

小鼠神经功能缺损评分参照《现代药理实验方法学》进行小鼠的神经功能缺损评分，评分≥5分表明造模成功，剔除模型组及实验组造模评分＜5分的小鼠，评分越高代表小鼠神经功能缺损越严重。

1.2.3

TTC染色法测定小鼠的脑梗死体积给药7 d后对小鼠进行麻醉并处死，断头取出脑组织去掉嗅觉、小脑和低位脑干后，在海马齿状回平面连续冠状切片，切成5组，每组约2 mm厚，置于2%的TTC溶液中避光染色，10%甲醛固定12 h，用图像分析软件计算梗死体积百分比，其中红色为正常脑组织，白色为脑梗死组织。

1.2.4

TUNEL检测测定脑梗死小鼠缺血侧海马区神经元凋亡上述脑组织冠状切片脱蜡、水化后严格按照试剂盒说明书进行操作。染色后显微镜下观察并记录每个视野中细胞核被染成棕褐色和蓝色的个数，每组记录5个视野，计算平均凋亡率。其中细胞核被染为棕褐色的是凋亡细胞，细胞核被染为蓝色的是正常细胞。计算凋亡率=100%×凋亡细胞数/（凋亡细胞数+正常细胞数）。

1.2.5

实时荧光定量PCR检测急性脑梗死小鼠脑组织ERK1/2、Bcl-2、Bax mRNA的相对表达量将小鼠梗死区脑组织消化离心后提取总RNA，测定总RNA浓度并将其浓度调节为1 mg/L，经37℃，30 min，85℃，30 s反转录为互补DNA（cDNA）。cDNA用超纯水稀释后进行定量PCR，PCR扩增条件：95℃，30 s，95℃，5 s，60℃，31 s，40个循环，95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，15 s。以GAPDH作为参照，用2法计算mRNA的相对表达量。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.6

蛋白质印迹法检测急性脑梗死小鼠脑组织p-ERK1/2、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白的相对表达量将小鼠梗死区脑组织细胞裂解后，根据蛋白定量试剂盒提取总蛋白，测定总蛋白的浓度，取40 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕凝胶上的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜，用丽春红染色后加入5 %脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加入ECL发光试剂，曝光后采集图像，计算各蛋白相对内参蛋白GAPDH的表达。

2 结果

2.1 CIG对急性脑梗死小鼠神经功能的影响

给药前，对照组、模型组、实验组小鼠神经功能缺损评分分别为0分、（9.500±0.837）分、（9.667±0.516）分（

H=

12.793，

P

=0.002），模型组和实验组评分显著高于对照组（

P

＜0.05），但是模型组和实验组差异无统计学意义（

P

＞0.05），说明造模成功。给药后，对照组、模型组、实验组小鼠神经功能缺损评分分别为0分、（3.667±0.516）分、（2.333±0.516）分（

H=

15.395，

P

＜0.001），实验组评分显著低于模型组（

P

＜0.05），说明CIG能明显缓解脑梗死小鼠的神经功能损伤。

2.2 CIG对急性脑梗死小鼠脑梗死体积的影响

给药7 d后，对照组、模型组、实验组脑梗死小鼠脑梗死体积分别为0、（40.572±10.580）%、（22.795±

6.680

）%，实验组小鼠脑梗死体积明显小于模型组（

H=

13.008，

P

=0.001），说明CIG能明显缩小脑梗死小鼠的脑梗死体积，见图1。

2.3 CIG对急性脑梗死小鼠梗死区神经元凋亡率的影响

对照组小鼠脑组织中神经元细胞核基本未出现棕黄色，TUNEL检测阳性细胞很少，神经元的凋亡率为（1.983±1.071）%；模型组小鼠脑组织中出现较多深褐色、形态不规则、大小不一的固缩核细胞，神经元凋亡率为（79.678±7.203）%；实验组小鼠脑组织中出现深染、固缩核细胞的数量明显较模型组少，神经元凋亡率为（49.171±10.914）%，明显高于对照组（

P

＜0.05），少于模型组（

P

＜0.05），说明CIG可明显减少脑梗死小鼠脑组织的神经元凋亡。见图2。

2.4 CIG对急性脑梗死小鼠脑组织凋亡相关因子Bcl

-

2、Bax表达的影响

实时荧光定量PCR实验及蛋白质印迹法结果均显示，三组小鼠脑组织中Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表达差异有统计学意义（均

P

＜0.001），实验组小鼠脑组织中Bcl-2 mRNA及其蛋白的表达明显较对照组下调（

P

＜0.05），较模型组上调（

P

＜0.05）；Bax mRNA及其蛋白的表达明显较对照组上调（

P

＜0.05），较模型组下调（

P

＜0.05），说明CIG能明显上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达。见图3、表2。

图3 山茱萸环烯醚萜苷（CIG）对急性脑梗死小鼠脑组织凋亡相关因子B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X（Bax）蛋白表达的影响

表2 山茱萸环烯醚萜苷（CIG）对急性脑梗死小鼠B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X（Bax）mRNA和蛋白表达的影响/±s

2.5 CIG对急性脑梗死小鼠ERK1/2表达的影响

实时荧光定量PCR实验结果显示，对照组小鼠ERK1/2 mRNA表达量为（1.14±0.28），模型组小鼠ERK1/2 mRNA表达量为（1.21±0.12），实验组小鼠ERK1/2 mRNA表达量为（1.16±0.14），三组小鼠脑组织中ERK1/2 mRNA表达差异无统计学意义（

F=

0.238，

P

=0.791）；蛋白质印迹法结果显示，三组小鼠脑组织中ERK1/2蛋白的表达差异无统计学意义（

P

=0.633），实验组p-ERK1/2蛋白的表达明显较对照组和模型组上调（

P

＜0.05），模型组p-ERK1/2蛋白的表达明显较对照组上调（

P

＜0.05），说明CIG可促进脑组织中ERK1/2的磷酸化，见图4、表3。

表3 山茱萸环烯醚萜苷（CIG）对急性脑梗死小鼠ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响/±s

图4 山茱萸环烯醚萜苷（CIG）对急性脑梗死小鼠p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达的影响

3 讨论

脑梗死会造成缺血缺氧中心区的神经细胞迅速坏死，处于缺血半暗带的细胞易受到氧化应激、炎症反应及兴奋性毒性等刺激，若未得到及时有效的治疗，神经细胞会发生凋亡，并产生不可逆的脑损伤。因此，减少缺血半暗带尚未病变的神经细胞凋亡成为治疗缺血性脑病的关键。CIG具有广泛的生物活性，能够抑制免疫作用、抗炎、抗血栓等。有研究发现，CIG的单体能降低大鼠脑缺血再灌注3d皮层梗死周边区基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9的表达，从而保护血脑屏障功能。Qu等研究发现，CIG可通过抑制Janus激酶/信号转导与转录激活子信号（JAK/STAT）通路抑制神经炎症和小角质细胞活化，其可能是预防多发性硬化症等神经系统疾病的治疗药物。本研究结果显示，实验组小鼠的神经功能损伤评分显著低于模型组，脑梗死体积和海马区神经元细胞的凋亡率显著低于模型组。提示CIG可明显改善小鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积及神经元细胞的凋亡。

神经元细胞的凋亡受多种因素调控，Bcl-2和Bax均是与细胞凋亡相关的基因，二者相互作用共同参与细胞的程序性凋亡过程。Bcl-2可与Bax蛋白形成多种二聚体，Bcl-2/Bcl-2、Bax/Bax、Bcl-2/Bax，而氧自由基及脂质过氧化物的生成、Ca超载均与二聚体比例有关。本研究结果显示，实验组小鼠脑组织中Bcl-2 mRNA及蛋白的表达明显较模型组上调，Bax mRNA及蛋白的表达明显较模型组下调。提示了CIG可上调急性脑梗死小鼠Bcl-2的表达，下调Bax的表达，抑制细胞凋亡。

ERK1/2介导信号通路是经典的MAPK信号转导途径，与神经元的生存和死亡密切相关。ERK1/2被磷酸化激活后会进入细胞核，参与某些基因的转录与表达，从而调节细胞的增殖与凋亡。Li的研究结果显示，激活的ERK可降低N-甲基-D-天冬氨酸受体活性，抑制Ca内流，发挥神经元保护作用。另有研究发现，大鼠脑梗死后p-ERK1/2表达增加，采用骨髓间充质干细胞（BMMNCs）干预后，p-ERK1/2的表达进一步上调，结果提示BMMNCs能够促进ERK1/2的磷酸化水平，从而改善神经功能，降低梗死范围。本研究实时荧光定量PCR实验及蛋白质印迹法均显示，与对照组及模型组比较，实验组小鼠脑组织中ERK1/2 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义，但是p-ERK1/2蛋白的水平明显较对照组和模型组升高。提示了CIG能促进急性脑梗死小鼠脑组织中ERK1/2的磷酸化。因此本研究推测CIG通过促进ERK1/2的磷酸化，使得细胞核ERK1/2被磷酸化为p-ERK1/2，并进入细胞核，从而调节Bcl-2及Bax的转录与表达，减少神经元细胞的凋亡。

综上所述，CIG具有缩小脑梗死体积、减少海马区神经元凋亡的作用，通过抑制Bax的表达，促进Bcl-2的表达实现其神经保护作用，可能通过调节ERK磷酸化实现调节抗凋亡及促凋亡蛋白之间的平衡，其具体机制还有待进一步的研究。

注：图2中箭头表示凋亡的神经元细胞。