虎杖苷通过蛋白激酶B信号通路影响胃癌细胞增殖凋亡

张翠翠，李强

作者单位：1枣庄矿业集团枣庄医院消化内科，山东 枣庄277100；2枣庄市立医院消化内科，山东 枣庄277100

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其严重影响着人类的生活质量，胃癌具有恶性程度高、易复发等特点，寻找有效的药物治疗胃癌是目前医学工作者研究的热点。虎杖苷是从虎杖中提取出来的芪类化合物，是白藜芦醇同葡萄糖的结合产物，虎杖苷具有广泛的药理学作用，如平喘、镇咳、降低胆固醇等。以前的研究表明，虎杖苷能够抑制肿瘤生长，对于白血病、乳腺癌等肿瘤细胞具有抑制作用，并且可以诱导肿瘤细胞凋亡发生。虎杖苷抗肿瘤机制较为复杂，在研究虎杖苷诱导宫颈癌细胞凋亡的实验研究中发现，其可以通过下调蛋白激酶B（Akt）信号通路的激活水平发挥抗肿瘤功效。目前对于虎杖苷在胃癌细胞增殖和凋亡中的作用和机制还不清楚。本次实验于2018年1月至2019年4月用虎杖苷处理体外培养的胃癌细胞，通过MTT法等多种实验技术手段探究虎杖苷对胃癌细胞增殖、克隆、周期、凋亡的作用和机制，为虎杖苷治疗胃癌的临床应用提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

胃癌细胞SGC-7901购自南京科佰生物科技有限公司；周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）抗体、Bcl-2相关X（Bax）蛋白抗体购自美国Sigma-Aldrich；剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；虎杖苷购自北京索莱宝科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；细胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；磷酸化Akt（p-Akt）抗体购自美国Santa Cruz；Akt信号激活剂胰岛素样生长因子-1（IGF-1）购自美国Sigma。

1.2 MTT法测定虎杖苷处理后胃癌细胞增殖活性

胃癌细胞接种到96孔板中，分成两组，依次为对照组和虎杖苷组，虎杖苷组分成5个浓度梯度分别为2、4、6、8、10 μmol/L，对照组为0 μmol/L。细胞培养48 h以后，分别在每个孔中添加10 μL的噻唑蓝（MTT）溶液，继续放在37℃的培养箱中孵育4 h。然后把孔内的液体弃掉，添加150 μL的二甲基亚砜（DMSO）溶液，震荡反应10 min。以不含细胞的空白孔调零，检测490 nm的吸光度。

1.3 平板克隆实验测定虎杖苷处理后胃癌细胞克隆形成能力

胃癌细胞按照对照组和虎杖苷分组每个孔中添加250个细胞接种到6孔板中，放在细胞培养箱中培养14 d。添加磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤细胞，然后以4%的多聚甲醛溶液固定20 min。将甲醛弃掉，添加10%结晶紫染色30 min。在室温中晾干，在光学显微镜下观察并计数细胞克隆形成数目。随机选择5个实验，计算平均值。

1.4 PI单染法测定虎杖苷处理后胃癌细胞周期变化

收集培养处理48 h以后的对照组和虎杖苷组细胞，添加事先预冷后的PBS溶液，以1 000

g

离心10 min。把上清吸除，然后添加50 μL的PBS溶液，继续加入70%的乙醇，放在4℃条件下反应12 h。1 000

g

离心10 min，吸弃上清，添加PI染色液500 μL，在37℃条件下反应30 min。流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.5 Annexin V

-

FITC/PI双染法测定虎杖苷处理后胃癌细胞凋亡变化

收集培养处理48 h以后的对照组和虎杖苷组细胞，以PBS将细胞洗涤2次，以250 μL的结合缓冲液将细胞悬浮，细胞浓度为1×10个/毫升。收集1 mL细胞至流式管中，然后添加PI和Annexin V-FITC溶液各5 μL到细胞中，放在避光条件下结合15 min。添加400 μL的结合缓冲液，流式细胞仪检测凋亡。

1.6 蛋白质印迹法（Western blotting）测定虎杖苷处理后胃癌细胞中cyclin D1、CDK4、Bax、Cleaved

caspase

-

3、p

-

Akt蛋白水平

收集培养处理48 h以后的对照组和虎杖苷组细胞，在细胞中添加RIPA裂解试剂，放在冰上裂解20 min。然后根据BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白的浓度。制备8%的分离胶以及5%的浓缩胶，按照每孔中加入40 μg的蛋白样品上样，预染蛋白Marker上样量为5 μL。在浓缩胶中设置80 V电压电泳，在分离胶中设置110 V电压电泳。将凝胶取出，以100 V电压转膜，将蛋白从凝胶上转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，转膜装置放在冰上操作。PVDF膜置于封闭液（5%牛血清白蛋白溶液）中，于室温孵育2 h。然后将PVDF膜放在一抗中，在低温4℃条件下孵育12 h。最后把PVDF膜放在1∶2 000稀释以后的二抗反应液中，在室温中孵育2 h。将ECL超敏液滴加到PVDF膜上，以Bio-rad采集图像，分析蛋白灰度值。内参为GAPDH，分析目的蛋白表达水平。

1.7 Akt信号激活剂IGF

-

1对虎杖苷调控胃癌细胞增殖、克隆、周期、凋亡的影响

以含有3 μg/L的Akt信号激活剂IGF-1和6 μmol/L的虎杖苷细胞培养液培养胃癌细胞，设置为虎杖苷+IGF-1组，以虎杖苷组为对照，以上述MTT、平板克隆实验、PI单染、Annexin V-FITC/PI双染以及蛋白质印迹法检测细胞增殖、克隆、周期、凋亡和cyclin D1、CDK4、Bax、Cleaved-caspase-3、p-Akt蛋白水平。

2 结果

2.1 虎杖苷抑制胃癌细胞增殖

对照组、2、4、6、8、10 μmol/L虎杖苷组吸光度分别为（0.58±0.06）、（0.45±0.03）、（0.38±0.03）、（0.31±0.02）、（0.25±0.02）、（0.20±0.01），

F

=166.429，

P

＜0.001。胃癌细胞经过虎杖苷处理以后，细胞吸光度降低（

P

＜0.05）。6 μmol/L的虎杖苷对胃癌细胞抑制率接近50%，后续实验选用6 μmol/L的虎杖苷处理胃癌细胞。

2.2 虎杖苷抑制胃癌细胞克隆形成并阻滞细胞周期

结果见表1和图1，胃癌细胞经过虎杖苷处理以后，细胞克隆形成数目下降，G0/G1细胞比例升高，细胞中周期蛋白cyclin D1、CDK4表达水平下降。虎杖苷抑制胃癌细胞克隆形成并阻滞细胞周期。

表1 虎杖苷处理后胃癌细胞克隆形成数目、细胞周期分布以及细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）蛋白水平变化/±s

图1 蛋白质印迹法检测虎杖苷处理后胃癌细胞中细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）蛋白水平

2.3 虎杖苷诱导胃癌细胞凋亡

结果见图2、图3、表2，胃癌细胞经过虎杖苷处理以后，细胞凋亡率升高，细胞中凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3表达水平升高。虎杖苷诱导胃癌细胞凋亡。

图2 流式细胞术测定虎杖苷处理后胃癌细胞凋亡变化 图5 流式细胞术测定虎杖苷和蛋白激酶B（Akt）信号激活剂胰岛素样生长因子-1（IGF-1）共同处理后胃癌细胞凋亡情况

表2 虎杖苷处理后胃癌细胞凋亡率和Bcl-2相关X（Bax）、剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）蛋白水平/±s

图3 蛋白质印迹法测定虎杖苷处理后胃癌细胞中Bcl-2相关X（Bax）、剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）蛋白水平

2.4 虎杖苷抑制胃癌细胞中Akt信号通路激活

结果见图4，胃癌细胞经过虎杖苷处理以后，细胞中Akt信号通路蛋白p-Akt水平降低［（0.51±0.05）比（0.24±0.03），

t

=13.891，

P

＜0.001］。虎杖苷降低胃癌细胞中Akt信号通路激活水平。

图4 蛋白质印迹法测定虎杖苷处理后胃癌细胞中磷酸化-Akt（p-Akt）蛋白表达

2.5 Akt信号激活剂IGF

-

1逆转虎杖苷对胃癌细胞增殖、克隆、周期、凋亡的影响

结果见图5、图6、表3，Akt信号激活剂IGF-1可以提高虎杖苷作用条件下胃癌细胞吸光度和克隆形成数目，减少G0/G1期细胞比例，减少细胞凋亡，提高细胞中cyclin D1、CDK4蛋白表达水平，减少细胞中Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达，提高细胞中p-Akt/Akt水平。Akt信号激活剂IGF-1逆转虎杖苷对胃癌细胞增殖、克隆、周期、凋亡的影响。

表3 虎杖苷和Akt信号激活剂胰岛素样生长因子-1（IGF-1）共同处理后胃癌细胞吸光度、克隆形成数目、周期分布、凋亡率和细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、Bcl-2相关X（Bax）、剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化-Akt（p-Akt）蛋白水平/±s

图6 蛋白质印迹法测定虎杖苷和Akt信号激活剂胰岛素样生长因子-1（IGF-1）共同处理后胃癌细胞中细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、Bcl-2相关X（Bax）、剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化-Akt（p-Akt）蛋白水平

3 讨论

虎杖苷是从虎杖中提取出来的一种单体，是一种羟基二苯乙烯类化合物，国内外的研究显示，虎杖苷可以加强心肌舒张及收缩功能、抑制血栓形成、改善微循环、降血脂，对于结肠炎、子宫内膜异位症导致的疼痛也具有改善作用。虎杖苷具有肿瘤预防和治疗的作用，其对于小鼠移植性肝癌具有抑制作用，能够明显降低肺癌、宫颈癌等细胞生长速度。本次实验显示，虎杖苷处理后的胃癌增殖、克隆能力均下降，提示虎杖苷可以抑制胃癌细胞增殖，虎杖苷具有抗胃癌进展的作用。

本次实验还发现虎杖苷处理后的胃癌细胞G0/G1比例升高，细胞凋亡增加，说明虎杖苷可能通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤功效。细胞周期是细胞增殖的基础，分裂间期是细胞增殖能力改变的关键。G0/G1期是DNA物质准备阶段，受到细胞内多种蛋白的调控作用，cyclin D1是细胞周期素中与肿瘤关系最为密切的调节因子，其是CDK4的调控亚基，参与细胞从G0/G1期向S期转变过程，cyclin D1可以与CDK4结合刺激细胞生长，影响细胞周期进展。细胞凋亡与细胞周期一样，受到细胞内凋亡蛋白的表达调控作用，Caspase蛋白家族是目前研究最多的与细胞凋亡有关的直接调控因子，其含有多个蛋白成员，分别在细胞凋亡反应中发挥不同的作用，Caspase-3是位于凋亡级联反应下游的执行因子，正常情况下以没有活性的酶原形式存在，只有被激活形成Cleaved-caspase-3后才可以不可逆的诱导细胞凋亡发生。Bax是Bcl-2蛋白家族成员，其在细胞凋亡过程中发挥促进作用，是一种促凋亡蛋白。我们的实验表明，虎杖苷处理后的胃癌细胞中cyclin D1、CDK4蛋白水平下降，Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平升高，提示虎杖苷阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡作用，这与细胞周期和凋亡检测结果一致，进一步证实了虎杖苷对胃癌细胞的作用。

目前对于虎杖苷抗肿瘤机制的研究表明，其可以通过下调细胞中Akt信号通路的激活水平抑制宫颈癌细胞生长。Akt信号通路具有多种作用，在人体组织中广泛存在，对于细胞生长、凋亡等具有明显的调控功能。研究报道证实，肿瘤组织中存在Akt信号通路过度激活现象，而抑制Akt信号激活可以抑制肿瘤细胞的恶性生长。p-Akt是Akt的磷酸化形式，其水平升高是Akt信号激活的标志。本次实验显示，虎杖苷处理后的胃癌细胞中p-Akt水平降低，并且Akt信号激活剂可以逆转虎杖苷对胃癌细胞增殖、克隆抑制和细胞周期阻滞以及细胞凋亡促进作用，证实虎杖苷抗胃癌细胞恶性生物学行为机制与Akt信号有关。

总之，虎杖苷能够在体外抑制胃癌细胞的恶性生长、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡，虎杖苷对于胃癌进展具有抑制作用，其作用机制与下调Akt信号激活水平有关。我们的结果为研究虎杖苷抗肿瘤机制提供了参考，为虎杖苷治疗胃癌的临床应用提供了理论资料。