发卡状银纳米簇荧光探针用于基因检测

张 浩，赵 影，娄大伟

(吉林化工学院 化学与制药工程学院,吉林 吉林 132022)

基因检测对遗传疾病诊断、癌症治疗和传染病控制意义非凡[1].2002年爆发的非典与2019年的新冠肺炎这两种重大传染病都与病毒有关,在这两件实例中基因检测是有效的筛查手段.除传染病外,细菌对抗生素治疗的耐药性也是我们面对的难题,2015年研究者发现了一种抗生素耐药性基因相关的耐药机制[2].这些事例表明,展开对基因检测方法的研究是非常有必要的.目前基因检测的方法有毛细管电泳法[3]、聚合酶链反应(PCR)[4]、电化学发光法[5]等,而这些方法不可避免的要经历耗时繁琐的步骤和高昂的成本,建立一种成本低廉、方便快速的基因检测方法成为近年来的研究热点.

DNA是生物学中遗传信息的主要分子载体[6],它的构象非常灵活,随着人工合成DNA技术的发展,DNA被越来越多的人用作纳米颗粒模板[7].银纳米簇(AgNCs)由几个至几百个银原子组成[8],由于其在纳米尺度上的光学性能优于其他过渡金属而被广泛关注[9],使用DNA为模板合成的银纳米簇(DNA-AgNCs)具有生物相容性好、光学性质稳定等特点[10],基于发卡状银纳米簇荧光探针为基因检测提供了一种降低成本、简化操作过程的新思路.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硝酸银(AgNO3)和硼氢化钠(NaBH4)购买自国家医药集团化学试剂有限公司.实验中涉及的试剂均为分析纯且无进一步纯化.实验中使用的超纯水均取自Mill-Q试剂水系统.荧光发射光谱测试结果记录于F97XP(上海棱光技术有限公司)荧光分光光度计,激发波长为466 nm,激发带宽与发射带宽分别为10 nm.荧光银纳米簇在SHA-C 恒温往复水浴锅中合成.缓冲溶液pH值通过Sartorius PB-10 pH计(中国北京标准仪器有限公司)校准.本文涉及的DNA样品购买于上海Sangon 生物科技有限公司,其序列如表1所示.

表1 DNA序列

1.2 实验过程

银纳米簇的制备:在小管中依次滴入10 μL 30 μM发卡状探针probe,50 μL 100 μM pH=7.4的Tris-HNO3缓冲溶液，40 μL水,室温震荡2 h,随后加入100 μL Tris-HNO3和60 μL水10 μL 180 μM AgNO3溶液,震荡5 min后加入10 μL 180 μM NaBH4溶液继续震荡5 min随后25 ℃水浴6 h.

可行性试验:分别制备空白样与试验样,空白样A中仅含有发卡状探针probe,试验样B中同时含有发卡状探针probe与乙肝病毒合成序列HBV[11],在荧光分光光度计上分别检测二者荧光强度并记录.

制备条件的探究:为了优化实验条件,对制备过程中的合成时间,反应温度以及探针与硝酸银的摩尔比进行了探究.

HBV序列的检测:使用探针probe对人工合成序列HBV的一系列浓度进行了荧光强度的检测.

选择性试验:选择3种与HBV相似但不同的DNA序列作为类似物对探针的选择性进行了探究.

2 结果与讨论

2.1 机理及可行性分析

当待测液中不含HBV时,探针probe自发组装为发卡状,此时向溶液中加入硼氢化钠来还原硝酸银得到的银纳米簇呈现较弱荧光.向探针probe中加入HBV后,HBV的序列与环状识别区结合形成稳定的双螺旋结构,将发卡状探针probe打开,此时在溶液中再加入硼氢化钠与硝酸银时整个体系的荧光强度显著增加.这个现象是因为选用了一个能生成银纳米簇的DNA模板序列C3AC3AC3TC3A[12].在发卡打开时,此模板形成i-motif结构,可作为模板诱导合成有荧光的银纳米簇.发卡没打开的时候,部分形成的DNA双链结构会阻碍i-motif结构的形成,从而导致荧光强度下降.荧光强度的变化与HBV的浓度正相关,据此实现对HBV的基因检测.

对提出的检测方法进行可行性分析.如图1(a)所示,使用466 nm为激发波长时在540 nm处得到明显的吸收峰,这表明合成了发射蓝绿光的荧光银纳米簇.分别测试了当待测液中仅含有探针probe和探针probe与HBV共存时的荧光发射光谱,结果如图1(b)所示,向探针probe中加入HBV后体系荧光明显增强,我们可以依据荧光变化程度对HBV浓度进行检测.

(a)探针DNA1检测HBV的机理图

Wavelength/nm(b)探针DNA1的激发光谱与发射光谱

Wavelength/nm(c)空白样品与试验样品的荧光发射光谱图1 可行性分析

2.2 实验条件的优化

在银簇合成过程中,时间与温度等实验条件对银簇有较大影响,因此对合成时间、反应温度以及探针probe与硝酸银的摩尔比进行了研究.实验结果如图2所示,如图2(a)所示,随着反应时间的增长,荧光的变化程度在逐渐增大,6 h以后荧光强度的变化程度趋于平缓,这说明银纳米簇在6 h就可完全形成,因此合成时间选择6 h.在合成银簇的实验中,4 ℃与25 ℃是两个常用温度,所以我们对其进行了探索,结果如图2(b)所示,在同样反应了6 h后,反应温度为25 ℃时荧光强度的变化更为明显,所以选择25 ℃作为反应温度.此外,分别探究探针probe与硝酸银摩尔比为1：3、1：6、1：9、1：12、1：15时的荧光变化程度,图2(c)表明n(DNA1)：n(AgNO3)为1：6时实验效果最好,此实验结果也符合银纳米簇模板序列i-motif结构的化学计量学比例.所以我们在25 ℃,n(DNA1)：n(AgNO3)为1：6,反应6 h的条件下来制备荧光银纳米簇.

t/h(a)时间与荧光变化程度的关系

T/℃(b)温度与荧光变化程度的关系

(c)DNA和硝酸银之间的摩尔比与荧光变化程度的关系图2 实验条件的优化

2.3 基因序列的检测

用设计好的探针probe对一系列不同浓度的HBV进行检测,具体浓度分别为0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1 μM.检测结果如图3所示,图3(a)表明随着HBV在待测液中浓度的升高,发生了轻微蓝移,荧光强度也随之加强,且在0.05～1 μM间有良好的线性关系,线性方程为F=545.92+1266.85C(HBV),检出限为0.016 μM.

Wavclength/nm(a)含有一系列不同浓度HBV待测液的荧光发射光谱

Concentration/μm(b)HBV浓度与荧光强度的关系图3 HBV的检测

2.4 选择性

为了探究探针probe对HBV的选择性,选择了3种与HBV相似但不同的人工合成序列作为类似物,并对其进行分析.结果如图4所示.

图4 探针DNA1对HBV的选择性

探针对HBV的响应最高,其他类似物的序列无法打开发卡状结构,说明所设计的探针选择性良好.

3 结 论

基于人工合成DNA设计了一种探针来检测HBV,当HBV存在时会引起DNA结构变化来诱导合成荧光银纳米簇,并对反应时间、合成温度、摩尔比等对体系荧光有影响的因素进行了探究,在最优实验条件下该探针选择性良好,在0.05～1 μM间有良好的线性关系,检出限低,整个检测方法耗时短且成本低.