灭草松对穗状狐尾藻的毒性研究

吴 迟，孙 田，何明远，蒋红云，张 兰，张燕宁，毛连纲，朱丽珍，郑永权，刘新刚*

（1.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2.广西思浦林科技有限公司，南宁 530001）

水生植物在水体净化、环境监测等方面起着重要作用，利用水生植物进行农药毒性评价等相关工作也日益受到国内外研究人员的重视。穗状狐尾藻属小二仙草科，狐尾藻属，是一种多年生双子叶沉水植物，在我国各地池塘，沟渠中均有生长，具有改善水体物理环境，富集铁、钴等金属，净化水体，维持水体生物多样性等作用[1-3]。目前，穗状狐尾藻已被我国和OECD（经济合作与发展组织）作为标准生物用于化学农药的毒性测试。灭草松，又名苯达松，于20世纪60年代由巴斯夫公司开发，在1972年上市的农药品种。其主要用于防除水稻、玉米、大豆、花生等田中的阔叶杂草和莎草科杂草，是一种选择性触杀型苗后除草剂，通过叶片接触和根系吸收，传导到茎叶，阻碍植物进行光合作用和水分代谢，使植物因生理机能失调而死。自2009年起，灭草松的销售额保持稳步增长趋势，在世界水稻除草剂市场占据重要地位[4-5]。因此，笔者采用水相染毒的方法，以明确灭草松对穗状狐尾藻的毒性效应，并为灭草松的生态环境风险评估提供数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药剂

96.3%灭草松原药（bentazone），江苏瑞邦农药厂有限公司。

1.1.2 供试生物

穗状狐尾藻，水生藻安生物科技有限公司。试验前在水-沉积物系统中进行预培养7 d，生长状态良好，有根生成，无藻类污染。每天光照16 h，温度为20±2℃。

1.1.3 仪器设备

分析天平、半微量天平、便携式pH计、便携式溶解氧测定仪，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；组培架，北京中科起源科技有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪、InertSustain C18色谱柱，岛津企业管理（中国）有限公司。

1.2 试验方法

本研究主要根据OECD准则（No.239）[6]，采用水相染毒的方法，进行灭草松对穗状狐尾藻的毒性效应研究，并建立分析方法对灭草松进行真实浓度检测。

1.2.1 穗状狐尾藻毒性试验

按照等比序列设置了有效剂量为0.300、0.600、1.20、2.40、4.80、9.60 mg/L等6个试验处理，同时设空白对照组。对照组设6次重复，处理组设4次重复，每重复3棵藻。试验期间，每天光照16 h，温度为20±2℃，随时补充水分，溶液变化量保持在10%以内。14 d时，测量植物主茎，侧枝和根部的长度，同时测量植物地上部分和根部的鲜重。然后，于60℃条件下，将植物烘干至恒重，测量地上部分和根部的干重。试验结束后，计算14 d-EC50值。

1.2.2 分析方法建立

1.2.2.1 仪器方法

采用岛津LC-20AT高效液相色谱仪对灭草松进行真实浓度检测。仪器条件如下：色谱柱为InertSustain C18（4.6×150 mm，5μm），进样体积为10 μL，柱温箱为40℃，流动相为乙腈∶0.1%磷酸水溶液（V∶V=40∶60），流速为1.000 mL/min，检测器为紫外检测器SPD-20A，检测波长为230 nm，保留时间为7.70 min。

1.2.2.2 前处理方法

水样直接过0.22μm滤膜，上机检测。

1.2.2.3 水样检测

在试验开始0、7 d更换试验药液前后和14 d时，从对照组和处理组试验溶液中部取样检测。

1.3 数据分析

根据调查数据计算生物量增长抑制率和平均生长率抑制率，计算公式参照OECD准则（No.239）[6]，并采用统计软件SPSS17.0概率回归分析[7]计算灭草松对穗状狐尾藻的半效应浓度EC50值。

2 结果与分析

2.1 灭草松真实浓度检测

在试验开始0、7 d更换试验药液前后和14 d时采集试验溶液并对灭草松进行真实浓度检测。试验期间，实测浓度与理论浓度的最大偏差为9.17%，在理论浓度的±20%以内，实测浓度相对稳定，因此采用理论浓度计算毒性端点值[8-9]。灭草松对穗状狐尾藻毒性试验的暴露浓度见表1。

表1 灭草松测定结果

2.2 穗状狐尾藻毒性试验结果

试验结束后，分别以植物地上部分、根部和整株植物的长度，干重和鲜重作为测量变量，以平均生长率和生物量增长作为响应变量，计算各处理组的抑制率。结果显示，抑制率随灭草松浓度的升高而升高，呈现出显著的浓度-效应关系。以地上部分作为测量变量，长度、鲜重和干重的ErC50值分别为有效浓度1.48、1.59和1.05 mg/L，EyC50值分别为有效浓度0.783、0.638和0.453 mg/L；以根部作为测量变量，长度、鲜重和干重的ErC50值分别为有效浓度1.85、1.08和1.22 mg/L，EyC50值分别为有效浓度1.250、0.441和0.435 mg/L；以整株植物作为测量变量，长度、鲜重和干重的ErC50值分别为有效浓度1.59、1.45和1.09 mg/L，EyC50值分别为有效浓度0.923、0.570和0.446 mg/L。灭草松对穗状狐尾藻的毒性结果见表2、3。

表2 灭草松对穗花狐尾藻毒性结果（ErC50）

表3 灭草松对穗花狐尾藻毒性结果表（EyC50）

3 结果与讨论

灭草松，3-异丙基-(1H)-苯并-2,1,3-噻二嗪-4-酮-2,2-二氧化物，分析检测主要包括液相色谱法和气相色谱法。Thomas等[10]采用梯度淋洗将制剂混杂物中的灭草松溶解出来，然后用液相色谱进行测定。黄诚等[11]采用气相色谱法测定水中的灭草松含量。笔者采用高效液相色谱法检测试验溶液中灭草松的实际含量，线性回归方程的相关系数为1.000 0，添加回收有效浓度为0.100和50.0 mg/L时，回收率范围分别为101%～107%和101%～102%；相对标准偏差分别为2.10%和0.108%。该方法科学灵敏，符合水样中农药含量分析的要求。

在农业生产中灭草松因为具有防效好，杀草谱广等特点而被广泛上使用[12-13]。欧洲食品安全局（EFSA）数据[14]显示，20℃条件下，pH值为7和9时，灭草松在水中溶解度分别为7.7 g/L和17 g/L；25℃条件下，pH值为5、7和9时，水解稳定，即灭草松水中溶解度高，且在水中稳定。本研究结果表明，灭草松对穗状狐尾藻的根、茎和整株植物具有明显的毒性效应。因此，在使用过程中应合理使用灭草松，避免对水生植物产生毒性影响。