LC-MS/MS法测定骨肉瘤患者血清中甲氨蝶呤及其代谢产物7-羟基甲氨蝶呤的浓度*

周 青，张晏洁，薛 源，芮建中，周国华

东部战区总医院 临床药学科，南京210002

骨肉瘤是临床常见的原发性骨恶性肿瘤，好发于儿童与青少年，具有病情进展快、肺转移早、病死率高等特点。目前临床对骨肉瘤的治疗，多以外科治疗为主、化疗或其他治疗为辅[1]。近年来，国内外发布的最新的骨肉瘤诊疗相关指南均推荐甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作为骨肉瘤的一线化疗药物，而大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）联合亚叶酸钙（CF）解救疗法已成为治疗骨肉瘤的重要手段，该方案可显著提高患者的生存率[2]。但由于给药剂量大，MTX 在体内的血药浓度往往较高，在提高疗效的同时也导致毒副反应发生率相应增加，且MTX 在体内代谢具有显著的个体差异，需密切监测患者血药浓度，在确保疗效的同时也减少不良反应的发生。此外，越来越多的研究表明，MTX 体内主要代谢产物7-羟基甲氨蝶呤（7-OH MTX）的血药浓度与MTX 不良反应具有相关性[3]。因此，同时监测MTX 及7-OH MTX 的血药浓度可更为精准、灵敏地预判HD-MTX 临床不良反应的发生，这对于临床合理用药具有重要意义[4]。

本研究建立了一种快速、准确、灵敏的LC-MS/MS 定量分析方法，能够同时测定人血清中MTX 和7-OH MTX 的药物浓度，并应用于临床治疗药物监测（TDM），同时为MTX 人体药动学研究及个体化用药实践提供方法学参考。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；API 4000 三重四级杆质谱仪（美国AB 公司）；涡旋混合仪（美国Scientific Industries 公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman 公司）；十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 药品与试剂

甲氨蝶呤对照品（纯度99.8%，批号100138-201606，中国食品药品检定研究院）；7-羟基甲氨喋呤（7-OH MTX）对照品（纯度97%，批号4-JSH-16-2，Toronto Research Chemicals）；内标氨基蝶呤（IS）对照品（纯度≥97%，批号039M4021V，Sigma）。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；超纯水。

人血清（批号20200508，北京鑫泉永硕科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱温：35 ℃；流动相：含0.1%甲酸的水溶液（A 相）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（B 相）（梯度洗脱：0～0.5 min，95%A；0.5～1.2 min，95%～20%A；1.2～3.5 min，20%A；3.5～3.6 min，20%～95%A；3.6～6.5 min，95%A）；流速：0.4 mL·min-1；进样量：2 μL。

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾源（ESI）；正离子模式；离子源电压（IS）：5500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；碰撞气体（CAD）压力9 psi；气帘气（CUR）压力：25 psi；雾化气（GS1,N2）压力55 psi，辅助气（GS2,N2）压力55 psi。多反应监测（MRM）离子对，MTX、7-OH MTX和内标氨基蝶呤（IS）的监测离子对、去簇电压（DP）、入口电压（EP）、碰撞能量（CE）、碰撞室出口电压（CXP）等见表1。

表1 质谱条件

2.3 对照品和内标溶液的配置

分别精密称取MTX、7-OH MTX 对照品各5.0mg，分别置于10mL 量瓶中，用甲醇（含0.1N NaOH）溶解并定容至刻度，配制浓度均为500μg·mL-1储备液，于冰箱-80 ℃避光保存。使用时以甲醇-水（50/50）进一步稀释成所需浓度的MTX 和7-OH MTX 标准曲线工作液（浓度分别为MTX：20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10 000 ng·mL-1；7-OH MTX：200、500、1000、2000、5000、10 000、20 000、50 000、100 000 ng·mL-1）。

精密称取氨基蝶呤对照品5.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制浓度为500 μg·mL-1储备液，于冰箱-80 ℃避光保存。最后用甲醇稀释至浓度为20 ng·mL-1的内标工作液。

2.4 样品处理

精密吸取血清40 μL，置1.5 mL EP 管中，再加入含氨基蝶呤的内标工作液（20 ng·mL-1）160 μL，涡旋混匀1 min，12 500 r·min-1离心10 min；取上清液至进样瓶，作LC-MS/MS 分析。

2.5 专属性考察

在“2.1 和2.2”项检测条件下，取空白人血清、空白人血清+MTX+7-OH MTX、骨肉瘤患者MTX 化疗后血清，分别按“2.4”项下方法处理样品后，进样分析。结果表明，MTX、7-OH MTX 和内标IS 的色谱峰形良好，其保留时间分别为2.71、2.73 和2.68 min，而空白血清中未发现有内源性物质干扰待测物和内标的测定，表明该方法专属性良好。见图1。

图1 血清中MTX、7-OH MTX 和IS 的MRM 色谱图

2.6 标准曲线的绘制

取空白血清90 μL，分别加入10 μL 不同浓度的系列标准曲线工作液，配制成含MTX 浓度为2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1及含7-OH MTX浓度为20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10 000 ng·mL-1系列血清标准曲线样品，并按“2.4”项下方法处理，进样2 μL。经LC-MS/MS 分析，以样品峰面积与IS 峰面积之比（Y）为纵坐标，以血清样品浓度（X）为横坐标，作线性回归，经“1/X2”权重得MTX 和7-OHMTX 的回归方程；分别为：Y=0.0638X-0.0754（r=0.998 5），Y=0.005 3X+0.0452（r=0.998 4）。结果表明，MTX 及7-OH MTX 分别在2～1000 ng·mL-1及20～10000 ng·mL-1线性关系良好。

2.7 精密度与准确度试验

分别配制MTX 浓度为2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 浓度为20、40、800、8000 ng·mL-1的血清样品。按“2.4”项下方法处理血清样品，每个浓度日内平行测定6 份，连续测定3 天，根据当天的标准曲线，计算待测物峰面积与内标峰面积比值，代入相应标准曲线得到实测浓度，计算日内、日间精密度和准确度。结果见表2。

表2 血清中MTX 及7-OH MTX 浓度测定的精密度与准确度（n=6）

2.8 稳定性试验

分别配制MTX 浓度为80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 浓度为800、8000 ng·mL-1的血清质控样品。按“2.4”项下方法处理血清样品，分别考察血清样本室温下放置8 h、4 ℃中放置24 h、反复冻融3 次和-20 ℃冷冻放置7 d 后MTX 和7-OH MTX 的稳定性。每个浓度平行测定5 份。结果表明，两个浓度质控样品在4 种储存条件下稳定，结果见表3。

表3 血清中MTX 及7-OH MTX 浓度测定的稳定性（n=5）

2.9 基质效应与提取回收率

分别配制MTX 浓度为2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 浓度为20、40、800、8000 ng·mL-1的血清样品，按“2.4”项下方法处理血清样品，每个浓度平行测定5 份，进样获得相应峰面积A；另取空白血清，按“2.4”项下方法处理空白血清（其中，内标工作液换成纯甲醇），再用提取的上清液分别配制MTX浓度为2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 浓度为20、40、800、8000 ng·mL-1的样品，按“2.4”项下方法处理样品，每个浓度平行测定5 份，进样获得相应峰面积B；以流动相分别配制MTX 浓度为2、4、80、800 ng·mL-1、7-OH MTX 浓度为20、40、800、8000 ng·mL-1的样品。按“2.4”项下方法处理样品，每个浓度平行测定5 份，进样获得相应峰面积C。计算MTX、7-OH MTX 及IS 的基质效应和提取回收率，公式为：基质效应=（B/C）×100%；提取回收率=（A/B）×100%。结果见表4。

表4 血清中MTX、7-OH MTX 及IS 浓度测定的基质效应与提取回收率（n=5）

2.10 临床应用

临床骨肉瘤患者2 例，均为男性，年龄分别为17、19 岁，MTX 化疗剂量分别为5.38、6.00 g·m-2。给药后于不同时间点（～4 h、～8 h、～24 h、～48h、～72 h）测定血清中MTX 及7-OH MTX 的浓度，其中，第1、2、3 个时间点（～4 h、～8 h、～24 h）的血清，在按照“2.4”项下方法处理样品前，分别用空白血清稀释1000、200、10 倍。结果见表5、表6。

表5 骨肉瘤患者1 的血药浓度监测结果

表6 骨肉瘤患者2 的血药浓度监测结果

3 讨论

MTX 是一种抗叶酸类抗肿瘤药物，能够竞争性地抑制细胞中二氢叶酸还原酶的活性，阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸，使得嘌呤、嘧啶核苷酸的合成受阻，从而抑制DNA 的生物合成，最终抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）联合亚叶酸钙（CF）解救是治疗骨肉瘤重要方案之一。

MTX 细胞毒作用具有非特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时对快速分裂的正常细胞（骨髓细胞、肝细胞等）也会造成一定的细胞毒作用，而大剂量使用甲氨蝶呤则意味着毒性加剧。临床上常采用CF 进行解救，但CF 解救HD-MTX 引起的不良反应的同时也会拮抗MTX 的药理作用，减弱MTX 对肿瘤细胞的毒性作用，从而影响治疗效果；并且使MTX 药代动力学特征存在较大的个体差异。因此，HD-MTX化疗后，需进行MTX 血药浓度监测，适时、适量地给予CF 解救，在保证HD-MTX 治疗效果的同时，还能防止严重不良反应的发生。有研究表明，MTX体内主要代谢产物7-OH MTX 的血药浓度与MTX给药后的不良反应（肾毒性、肝毒性等）相关。因此，本研究选择同时测定MTX 和7-OH MTX 的血药浓度，为实行个体化用药提供科学的指导依据。

目前，临床常用的治疗药物监测方法有化学发光免疫分析法（CLIA）[5]和高效液相色谱法（HPLC）[6，7]。CLIA 法虽然操作相对简单、自动化程度高；但其配套的试剂盒成本较高，且易受代谢产物的干扰和发生交叉反应，会影响测定结果的准确性。HPLC 法虽然灵敏度高、选择性较好；但存在样品前处理复杂、分析时间较长等缺点，难以满足临床时效性和大样本的快速检测。相比而言，LC-MS/MS 法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、检测限低等优势。

综上所述，骨肉瘤患者经HD-MTX 化疗后，进行治疗药物监测，指导临床个体化用药是很有必要的。本研究建立了一种快速、简单、灵敏度高、准确度好的LC-MS/MS 检测方法，用于同时监测MTX及其代谢产物7-OH MTX 的血药浓度，对临床实施个体化HD-MTX 联合CF 治疗方案、保障治疗效果及用药安全具有指导意义。