夜宁胶囊的鉴别与含量测定*

倪玉佳，戈 煜，陈 颖，董文燊，瞿发林

1 第904 医院常州医疗区 药剂科，常州 213000；2 第904 医院无锡 药剂科，无锡214000

夜宁胶囊（曾用名：养血安神胶囊）为本院非标准制剂（批准文号：总JBF513002-2016），是参考《中国药典》[1]收载的制剂——夜宁糖浆，按原生产工艺及处方改良而制得。该制剂由首乌藤、浮小麦、灵芝、合欢皮、大枣、甘草、女贞子等7 味中药组成，主要用于神经衰弱以及心血不足所致的失眠、多梦、头晕、乏力的治疗。

在夜宁胶囊原质量标准[原中国人民解放军南京军区联勤部卫生部下发，批准文号：NFB-（Z158）-2011）]中，仅对首乌藤作薄层色谱鉴别及其中大黄素作含量测定[2,3]。且在前期试验中发现，浮小麦、女贞子对处方中合欢皮的鉴别有干扰，而甘草的薄层鉴别试验重现性不佳。故本研究增加了灵芝的鉴别，改良了首乌藤鉴别方法，同时选定主药之一——女贞子中特有成分特女贞苷进行含量检测[4]，有效提高了该制剂的质控标准。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

电子天平（XS105 型，梅特勒-托利多仪器有限公司）；高效液相色谱仪（waters2487，美国waters 公司）；pH 计（S210 型，上海梅特勒托利多仪器有限公司）；暗箱式紫外分析仪（ZF-20D，巩义市英峪予华仪器厂）。

1.2 药品与试剂

特女贞苷对照品（规格：20 mg，纯度：97.3%，批号：111926-201404），大黄素对照品（规格：20 mg，纯度：96.0%，批号：110756-201913），灵芝对照药材（规格：2 g，批号：120968-201809），首乌藤对照药材（规格：0.25 g，批号：120939-201507），均购自中国食品药品检定研究院。

夜宁胶囊（批号：20190226、20190410、20190522、20190716、20190910、20191106、20200114、20200331、20200811、20201117，规格：0.4 g），本院制剂室自制。

乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 首乌藤取本品胶囊内容物2 g，加入1.5 g硅藻土混匀，加入2.5 mol·L-1硫酸溶液20 mL，水浴回流1 h，放冷后加二氯甲烷30 mL，60 ℃水浴回流1 h，蒸干，加甲醇1 mL 溶解固体物，得供试品溶液。

取对照药材首乌藤0.5 g，按上述方法制成对照药材溶液。

取适量大黄素对照品，加甲醇配制成0.1 mg·mL-1的对照品溶液。

另按处方量制备缺首乌藤的阴性样品，同法制成阴性溶液。

吸取以上4 种溶液各4 μL，选择石油醚（沸程30℃～60℃）-甲酸-乙酸乙酯（15∶2∶5）的上层溶液为展开剂，展开，于同块硅胶G 薄层板上点样，热风吹干。供试品（批号：20191106）与对照品、对照药材的色谱相应位置上，紫外光灯（365 nm）下呈现黄色的荧光斑点，自然光下检视呈现黄色斑点。而方中的其他成分对首乌藤鉴别无干扰。见图1。

图1 紫外灯（A）及自然光（B）下首乌藤薄层色谱鉴别图

2.1.2 灵芝试验方法参考《中国药典》2020 年版一部P195-196“灵芝”药材鉴别，同法制成供试品溶液、对照药材溶液以及阴性溶液。供试品（批号：20191106）与灵芝对照药材色谱对应位置显相同荧光斑点（白色圆圈标注）。方中的其他成分对灵芝鉴别无干扰。见图2。

图2 灵芝薄层色谱鉴别图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性要求色谱柱：Lichrosphe C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水溶液（18∶82）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：224 nm；进样量：20 μL。

测定结果显示，理论板数按特女贞苷峰计不低于4000，且特女贞苷与相邻色谱峰的分离度均大于1.5。由图3 可见，阴性样品在特女贞苷相应出峰位置无响应，结果表明专属性良好。

图3 HPLC 色谱图

2.2.2 溶液的制备

对照品溶液（A）：精密称取特女贞苷对照品适量于瓶中，加甲醇超声处理使其溶解，制成0.1965 mg·mL-1的对照品溶液。

供试品溶液（B）：取夜宁胶囊内容物适量，研匀，精密称取0.25 g 于锥形瓶中，加入50%乙醇25 mL密塞称重，超声处理（220 V，50 Hz，30 ℃）30 min，放冷称重，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀、离心，取上清液即得。

阴性溶液（C）：按夜宁胶囊处方制备缺女贞子的样品，按供试品（B）的方法制备即得。

2.2.3 专属性考察按“2.2.1”项下色谱条件，分别将“2.2.2”项下3 种溶液进样分析。

2.2.4 线性关系精密吸取“2.2.2”项下A 溶液1mL，计5 份，分别稀释成2、5、10、25、50 mL，混匀。分别吸取上述5 种溶液及对照品原液，按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定。以特女贞苷的进样量（μg）作为横坐标，峰面积（A）作为纵坐标，采用线性回归得出标准曲线Y=1.187×103X-5.829×104（n=6），表明特女贞苷在78.6～3 930.9 μg（r=0.999 9）范围内呈良好线性关系。

2.2.5 进样精密度试验精密吸取“2.2.2”项下A溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定5 次，记录特女贞苷峰面积，计算得RSD 值为0.17%（n=5），说明此精密度较好。

2.2.6 重复性试验精密称取夜宁胶囊内容物（批号：20191106）0.25 g，共5 份，按“2.2.2”项下B 溶液方法制备样品，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录特女贞苷峰面积，根据外标法，计算5 份样品各自所含特女贞苷的含量，由记录所得的峰面积按外标法计算（增加计算方法）夜宁胶囊特女贞苷平均含量为4.55 mg·g-1，RSD 值1.03%（n=5），表明此方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验精密称取夜宁胶囊内容物（批号：20191106）0.25 g，按“2.2.2”项下B 溶液方法制备样品，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于18 h 内不同时间点（0、3、6、9、12、18 h）进样测定，记录特女贞苷峰面积，计算RSD 值为1.39%（n=6），说明夜宁胶囊溶液在室温下18 h 内具有较好的稳定性。

2.2.8 加样回收率试验精密称取夜宁胶囊内容物（批号：20191106）0.125 g，按0.5∶1、1∶1、1.5∶1 的比例，精密加入适量特女贞苷对照品溶液，平行制备9份样品，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录特女贞苷峰面积，根据外标法计算样品平均回收率为100.6%，RSD 为1.71%（n=9）。

2.2.9 样品含量测定分别取10 份不同批次的夜宁胶囊内容物适量，按“2.2.2”项下B 溶液方法制备样品，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，每个样品平行2 份，按外标法计算其平均含量。样品中特女贞苷含量见表1。

表1 样品中特女贞苷含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 薄层鉴定方面

原夜宁胶囊标准中，“首乌藤薄层鉴别”项的供试液制备方法较为繁琐，此次修订简化了若干步骤；此外，以石油醚（沸程：30 ℃～60 ℃）-甲酸-乙酸乙酯（15∶2∶5）的上层溶液作为展开剂代替原实验试剂，分离效果更佳。

3.2 含量测定方面

3.2.1 提取步骤的优化为优化夜宁胶囊中特女贞苷的提取效果，挑选了甲醇及不同浓度的乙醇作为提取剂进行了比较研究,实验结果表明，50%的乙醇提取率最高，且色谱图中峰型较好。对超声提取时间也进行了优化（10、20、30、40 min），结果表明，超声30 min能提取完全。在此基础上比较了水浴回流30min与超声提取的差别，发现含量略低于超声提取，可能是因为特女贞苷热稳定性差[5，6]，水浴回流的温度比超声提取的温度要高很多。

3.2.2 含量限度的制定《中国药典》针对原药材女贞子规定其特女贞苷含量不得低于0.70%[7]，按照本制剂处方量，在不考虑转移率的前提下，理论含量为0.95 mg·g-1（即0.38 mg/粒），而本院10 批夜宁胶囊含量结果均远高于最低理论限度。考虑到女贞子药材质量会受到产地、生长时间、加工方式等的影响，且制剂生产过程也会带来相应的误差，故以该10 批胶囊的含量的最低值向下浮动20%，暂定每粒夜宁胶囊含特女贞苷（C31H42O17）不得低于1.45 mg/粒。