HPLC一测多评法测定荜铃胃痛颗粒中8种成分的含量*

杨 光，陈淑敏，马灵珍

1 郑州颐和医院 药学部，郑州 450047；2 亳州职业技术学院 药学院，亳州236800

荜铃胃痛颗粒由吴茱萸、醋香附、醋延胡索、荜澄茄、黄连、海螺蛸等11 味中药加工而成，临床上主要用于对气滞血瘀以及慢性胃炎引起的胃脘疼痛的治疗[1]。荜铃胃痛颗粒收载于《中国药典》2015年版一部[1]，在现行质量标准和文献报道[2，3]中，仅对黄连所含盐酸小檗碱进行了定量测定，而盐酸小檗碱来源广泛，黄连、黄柏、三棵针等多种植物中均含有，此作为荜铃胃痛颗粒定量控制指标专属性不强。本实验按照中药质量标志物确认原则，采用HPLC-QAMS 法对荜铃胃痛颗粒中醋延胡索所含活性成分延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱，吴茱萸所含代表性成分吴茱萸碱和吴茱萸次碱，醋香附所含特征成分香附烯酮、圆柚酮和-香附酮含量进行同时测定，为提升荜铃胃痛颗粒质控方法提供支持。

1 仪器与药品、试剂

Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国沃特斯公司）；Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BP211D 型电子天平（德国Sartorius 公司）；SB25-12DT 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

荜铃胃痛颗粒（规格：每袋装5 g，批号：19061923、19102122、19110422）来源于扬子江药业。

对照品：吴茱萸碱（纯度：99.6%，批号110802-201710）、吴茱萸次碱（纯度99.7%，批号110801-201608）、α-香附酮（纯度99.4%，批号110748-202016）、延胡索乙素（纯度99.8%，批号110726-201819）均购自中国食品药品检定研究院；香附烯酮（纯度95.5%，批号18051522）购自上海同田生物技术股份有限公司；圆柚酮（纯度：97.4%，批号PRF8072622）、去氢紫堇碱（纯度：97.8%，批号PRF8062141）、紫堇碱（纯度：98.0%，批号PRF10052142）均购自成都普瑞法科技开发有限公司。

乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品贮备液分别精密称取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱对照品适量，用70%乙醇制成质量浓度分别为0.198、0.254、1.978、0.152、0.696、0.804、0.638、0.416 mg·mL-1混合对照品贮备液。

2.1.2 混合对照品溶液精密吸取“2.1.1”项下混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别用70%乙醇定容至20 mL，制成6 个系列浓度的线性考察用混标溶液Ⅰ～Ⅵ，取混标溶液Ⅳ作为混合对照品溶液（吴茱萸碱9.9 μg·mL-1、吴茱萸次碱12.7 μg·mL-1、香附烯酮98.9 μg·mL-1、圆柚酮7.6 μg·mL-1、α-香附酮34.8 μg·mL-1、延胡索乙素40.2 μg·mL-1、去氢紫堇碱31.9 μg·mL-1、紫堇碱20.8 μg·mL-1）。

2.1.3 荜铃胃痛颗粒样品溶液取荜铃胃痛颗粒内容物适量，研成细粉，取约2.0 g，称定，置25 mL量瓶中，加70%乙醇20 mL，超声处理30 min，放置室温后用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得荜铃胃痛颗粒样品溶液。

2.1.4 阴性样品溶液按荜铃胃痛颗粒质量标准[1]项下的处方和制法分别制备缺吴茱萸、缺醋香附和缺醋延胡索的阴性样品，再按“2.1.3”项下方法分别制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～9.0 min，32.0%A；9.0～16.0 min，32.0%A→48.0%A；16.0～27.0 min，48.0%A→65.0%A；27.0～43.0 min，65.0%A→82.0%A；43.0～50.0 min，82.0%A→32.0%A）；流速：0.9 mL·min-1；检测波长：215 nm（0～16.0 min 检测吴茱萸碱、吴茱萸次碱）[1，4]、242 nm（16.0～27.0 min 检测香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮）[5，6]和280 nm（27.0～50.0 min 检测延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱）[7，8]；进样量：10 μL。

2.3 专属性考察

精密吸取“2.1.2～2.1.4”项下溶液各10 μL，依法进样检测，色谱图见图1。结果显示，荜铃胃痛颗粒样品溶液色谱图中8 种成分色谱峰峰形对称，与相邻色谱峰分离度均>1.5，理论塔板数按各目标化合物色谱峰计均≥4000。阴性样品对荜铃胃痛颗粒中8 个成分的定量测定无干扰。

图1 8 种成分专属性HPLC 色谱图

2.4 线性关系制备

精密吸取“2.1.2”项下6 个系列浓度混标溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μL，依法进样测定8 种成分的峰面积，以质量浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，目标化合物峰面积（Y，mAU·min）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

2.5 进样精密度试验

精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液连续进样6 次，记录吴茱萸碱、吴茱萸次碱、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的峰面积，上述8 种成分峰面积的RSD 分别为1.11%、1.07%、0.58%、1.20%、0.82%、0.79%、0.93%和0.99%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批荜铃胃痛颗粒样品（批号：19061923）适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6 份样品溶液，依法进样测定，记录吴茱萸碱、吴茱萸次碱、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的峰面积，并采用外标法计算其含量，结果上述8 种成分含量的RSD 分别为1.74%、1.69%、0.95%、1.87%、1.52%、1.44%、1.36%和1.59%（n=6）。

2.7 稳定性试验

按“2.1.3”项下方法临用新配一份荜铃胃痛颗粒（批号：19061923）样品溶液，于0、2、4、8、16、24 h进样检测吴茱萸碱、吴茱萸次碱、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的峰面积，样品溶液24 h 内稳定，上述8 种成分峰面积的RSD分别为1.08%、1.10%、0.55%、1.17%、0.79%、0.81%、0.95%和1.01%（n=6）。

2.8 回收率试验

取8 种成分含量已知的同一批荜铃胃痛颗粒（批号：19061923）内容物适量，每份约1.0 g，共9份，精密称定，分别置于25 mL 量瓶中，按《中国药典》2015 年版四部要求，精密加入按照目标化合物含量另行配制的混合对照品溶液（吴茱萸碱0.114mg·mL-1、吴茱萸次碱0.156 mg·mL-1、香附烯酮1.212 mg·mL-1、圆柚酮0.094mg·mL-1、α-香附酮0.368 mg·mL-1、延胡索乙素0.412 mg·mL-1、去氢紫堇碱0.326 mg·mL-1、紫堇碱0.248 mg·mL-1）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，再按“2.1.3”项下方法制成加样样品溶液，依法测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的峰面积，采用外标法计算各目标化合物含量，结果上述8 种成分平均加样回收率及相对标准偏差（RSD）分别为98.74%（1.13%）、99.62%（0.87%）、100.01%（1.06%）、96.91%（1.17%）、99.35%（1.23%）、98.67%（1.32%）、97.60%（0.94%）和98.42%（0.79%）。

2.9 校正因子（f）的测定

精密吸取“2.1.2”项下的混标溶液Ⅰ～Ⅵ各适量，依法进样测定8 种成分的峰面积，以延胡索乙素对照品为参照，按f 计算公式：fR/S=fR/fS=（AS×cR）/（AR×cS）（其中AS代表内参物峰面积，cR代表其他目标化合物质量浓度，AR代表其他目标化合物峰面积，cS代表内参物质量浓度）分别计算得内参物与吴茱萸碱、吴茱萸次碱、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮、去氢紫堇碱和紫堇碱的平均校正因子为2.4155、1.8333、1.5623、3.1722、1.1284、1.2690 和1.5194，RSD 分别为0.94%、1.76%、0.77%、1.62%、1.05%、1.65%和1.27%。

2.10 f 耐用性考察

精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液，依法进样测定8 种成分的峰面积，对比考察仪器（Waters 2695 型、Agilent 1200 型高效液相色谱仪）、色谱柱（Agilent Eclipse C18、Topsil C18、Benetnach C18）、柱温（28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃）和流速（0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL·min-1）对f 的影响，结果不同仪器、色谱柱条件下吴茱萸碱、吴茱萸次碱、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮、去氢紫堇碱和紫堇碱的平均f 分别为 2.4174、1.8221、1.5584、3.1662、1.1239、1.2655 和1.5143，RSD为0.78%～1.66%；不同柱温条件下，各成分平均f分别为2.4146、1.8351、1.5629、3.1742、1.1313、1.2751 和1.5254，RSD 为0.63%～1.71%；不同流速条件下，各成分平均f 分别为2.4172、1.8380、1.5661、3.1731、1.1318、1.2741 和1.5243，RSD 为0.87%～1.68%。

2.11 目标化合物色谱峰的定位

精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液，依法进样检测，记录8 种成分色谱峰的保留时间，以延胡索乙素对照品为参照，以其相应的峰为S 峰，采用相对保留时间法（即各待测目标化合物与内参物保留时间的比值）对待测目标化合物色谱峰进行定位，对比考察上述2 种色谱仪、3 种色谱柱对相对保留时间的影响，结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱、香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮、去氢紫堇碱和紫堇碱的平均相对保留时间分别为0.3559、0.4419、0.5920、0.6414、0.7758、1.1094 和1.2930，RSD 分别为1.77%、1.46%、0.84%、0.76%、0.96%、1.08%和0.59%。

2.12 荜铃胃痛颗粒一测多评（QAMS）法与外标法（ESM）含量测定结果比较

取3 个批次荜铃胃痛颗粒样品适量，按“2.1.3”项下方法制备样品溶液（每个批次平行3 份），依法测定8 种成分的峰面积，采用外标法和一测多评法分别计算含量，结果两方法测定含量差别不大。见表2。

3 讨论

3.1 目标成分的选择

本实验依据中医配伍理论，参考中药质量标志物确认原则，选取君药之一醋延胡索所含活性成分延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱，臣药之一吴茱萸所含代表性成分吴茱萸碱和吴茱萸次碱，佐药之一醋香附所含特征成分香附烯酮、圆柚酮和-香附酮为定量测定目标化合物，为全面评价荜铃胃痛颗粒的整体质量提供参考依据。

3.2 流动相的选择

本实验在流动相选择中，参考相关文献对甲醇-水[5，6]、乙腈-0.1%冰醋酸溶液[7]和乙腈-0.1%磷酸溶液[4，8]流动相体系进行了对比考察，以8 种成分的分离效果为主要指标，发现甲醇-水流动相系统色谱图基线不平稳，影响检测结果；乙腈-0.1%冰醋酸流动相系统吴茱萸碱和吴茱萸次碱分离效果不佳；乙腈-0.1%磷酸流动相系统目标化合物分离效果较好，最终确定“2.2”项下的流动相系统。

本实验采用HPLC-QAMS 法对荜铃胃痛颗粒中8 种成分含量同时测定，建立了该品多指标化合物质量控制模式，该方法操作便捷，结果准确，降低了检验成本，为全面评价荜铃胃痛颗粒的整体质量、确保临床用药稳定可靠提供了实验支持。