微小RNA-145-5p与脓毒症急性肺损伤的相关性研究

邓慧兰 韩文慧 王辉 王洁

脓毒症会引起全身性炎性损伤和免疫抑制，且会导致多器官衰竭甚至死亡[1-2]。急性肺损伤(ALI)是脓毒症最常见的并发症，也是引起患者死亡的主要原因之一[3]。微小RNA(miRNA,miR)是一种长度约为22个核苷酸、不具有编码功能的单链RNA，miRNA的主要功能是通过特异性碱基配对的方式特异性的与mRNA的3’-非翻译区(UTR)直接结合，诱导RNA降解或翻译抑制，从而调节基因的表达[4]。miRNA参与几乎所有细胞进程，包括炎性反应[5]。一项动物研究结果显示，miR-145-5p水平升高与脓毒症有关[6]。由PRKAA1基因编码的AMP活化蛋白激酶(AMPK)蛋白具有调节自噬和抑制炎性反应的作用，有研究显示AMPK的激活可缓解脓毒症引起的ALI[7]。本研究主要探讨miR-145-5p与脓毒症ALI的相关性及其与AMPK在脓毒症ALI中的作用。

材料与方法

1.材料：雄性BALB/c小鼠(SPF级，8周龄，中国Laboratory Animal Cecter公司)、人正常肺上皮细胞BEAS-2B(美国ATCC公司)、LHC-8培养基(美国Invitrogen公司)、脂多糖(LPS，美国Sigma公司)、小鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(北京乐博公司)、倒置显微镜(日本Olympus IX71)、小动物血气分析仪ABL90(丹麦Radiometer公司)、miR-145-5p类似物(mimic)、AMPK过表达质粒以及相应的阴性对照(NC)质粒(美国Thermo Fisher公司)、Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)、荧光素酶报告检测仪1000 System(美国Promega公司)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)、逆转录cDNA试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR试剂盒(瑞士Roche公司)、ABI 7500 PCR检测系统(美国Life technology公司)、放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液(中国Beyotime公司)、anti-AMPK和二抗(美国Abcam公司)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜(美国Bio-Rad公司)。

2.方法

(1)小鼠分组及建模方法：将60只小鼠随机分为对照组(30只)和ALI组(30只)。通过呼吸道滴注LPS建立小鼠脓毒症ALI模型[8]。对小鼠进行血气采用分析后，使用5%的戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，采用颈椎脱臼法处死小鼠，收集其血液和肺组织待用。

(2)miR-145-5p靶向AMPK位点的预测和验证：通过工具网站starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)预测miR-145-5p靶向AMPK的潜在结合位点，然后通过荧光素酶报告验证。将野生型AMPK(LATS1-wt)或突变的AMPK(LATS1-mut)及miR-145-5p mimic克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体中。将BEAS-2B细胞接种在6孔板中，使用Lipofectamine 2000试剂盒，将两种载体转染至BEAS-2B细胞。使用荧光素酶报告检测仪1000 System评估荧光素酶活性。

(3)细胞分组和转染：将人正常肺上皮细胞BEAS-2B分为NC组、mimic组和mimic+AMPK组。mimic组和mimic+AMPK组使用Lipofectamine 2000分别转染mimic，mimic+AMPK组转染AMPK过表达质粒，NC组转染等量NC质粒作为对照，转染24 h后收集细胞。

(4)血气分析及ALI建模评估：在建模后通过小动物血气分析仪检测氧合指数[动脉血氧分压(PaO2)/吸入氧浓度(FiO2)]，根据参考文献[8]将PaO2/FiO2<300 mmHg定义为ALI建模成功。

(5)ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性因子水平：将小鼠麻醉后切开气管，并插入导管，使用0.5ml的生理盐水灌洗抽吸3次，然后将吸出的BALF离心(2 000 r/min)10 min取上清液，采用ELISA检测BALF中TNF-α和IL-1β水平。

(6)定量聚合酶链反应(qPCR)检测miR-145-5p和AMPK mRNA水平：通过Trizol获得肺组织和细胞中总RNA，然后检测RNA的纯度和浓度。使用cDNA试剂盒将1 μg RNA逆转录合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR实验(95 ℃/10 min，40个循环，94 ℃/15 s，60 ℃/1 min，60 ℃/1 min，4℃保存)。采用U6作为miRNA的内参，GAPDH作为AMPK的内参，通过比较循环阈值(ΔΔCt)分析表达水平，表达量比值即2-ΔΔCt。

(7)蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测AMPK蛋白：在液氮中将肺组织或细胞研磨然后使用RIPA裂解缓冲液裂解，使用BCA蛋白测定试剂盒测量总蛋白含量。然后使用SDS-PAGE分离等量的总蛋白(120 V下电泳90 min)，将蛋白转移到PVDF膜上(50 V，120 min)，在含有5%脱脂牛奶的封闭溶液中封闭。然后将PDVF膜与anti-AMPK(1∶500稀释)在4 °C下孵育过夜，然后加入1∶5 000稀释的HRP偶联二抗在室温下孵育1 h。采用电化学发光(ECL)试剂盒可视化蛋白条带，将GAPDH作为内参，使用ImagePD软件对蛋白条带的灰度进行定量分析。

结 果

1.对照组和ALI组小鼠建模情况：对照组小鼠建模前后PaO2/FiO2水平均正常，建模前(452.46±34.92)与建模后(443.28±41.26)比较差异无统计学意义(P>0.05)，而ALI组小鼠PaO2/FiO2水平从461.08±18.96降低至292.37±21.76，差异有统计学意义(t=32.020，P<0.001)，提示建模成功。

2.对照组和ALI组小鼠各项指标比较：ALI组小鼠肺组织miR-145-5p水平、BALF中TNF-α和IL-6水平均高于对照组，而肺组织中AMPK蛋白水平低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 对照组和ALI组小鼠各项指标比较

3.脓毒症ALI小鼠肺组织miR-145-5p与AMPK蛋白、BALF中炎性因子水平的相关性分析：脓毒症ALI小鼠肺组织miR-145-5p与AMPK蛋白呈负相关(r=-0.469，P=0.002)，与BALF中TNF-α(r=0.431，P=0.011)、IL-6(r=0.482，P=0.004)均呈正相关。

4.miR-145-5p与AMPK的靶向关系：本研究预测miR-145-5p靶向AMPK的结合位点，发现在人(has-)和小鼠(mmu-)中，miR-145-5p可与AMPK mRNA的3’UTR区域靶向结合。在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中进行双荧光素酶报告实验，结果显示，同时转染miR-145-5p mimic和AMPK-wt的细胞的荧光酶素活性明显降低(P<0.05)，表明miR-145-5p直接靶向AMPK，见表2。

表2 双荧光素酶报告结果(相对荧光强度，

5.各组细胞中miR-145-5p和AMPK水平比较：mimic组、mimic+AMPK组细胞中miR-145-5p水平均高于NC组(P<0.05)，而mimic组和mimic+AMPK组细胞中miR-145-5p水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。mimic组细胞中AMPK mRNA和蛋白水平均低于NC组，mimic+AMPK组细胞中AMPK mRNA和蛋白水平均高于mimic组(P<0.05)，而mimic+AMPK组和NC组细胞中AMPK mRNA及蛋白水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组细胞中miR-145-5p和AMPK水平比较

讨 论

脓毒症是重症监护病房患者死亡的最常见原因，全球每年约有1 800万患者，死亡率为28%～40%[9]。ALI是脓毒症最常见的并发症，其特征是肺部出现严重的急性炎症反应及后续的肺水肿和肺功能损伤。分析脓毒症ALI的炎性机制对治疗ALI具有重要意义。

miRNA具有在转录后水平调节基因表达的作用，并参与多种生命进程，其中包括炎性反应。研究显示miRNA在败血症中起重要作用，如miR-25可以抑制由脓毒症引起的心肌细胞炎性反应和细胞凋亡[10]。最新一项研究结果显示，miR-145可以直接靶向调控TGFBR2的表达，使TGFBR2/Smad2轴失活，从而参与脓毒症的发展，且与小鼠的总生存期有关[11]。既往研究结果显示，LPS诱导的炎性肺损伤小鼠肺组织中miR-145-5p表达水平升高，且与LPS浓度存在一定的依赖性，而miR-744-5p表达水平下调，无明显LPS浓度梯度依赖性[12]。由于临床上脓毒症ALI患者的肺组织很难获取，因此我们建立了小鼠脓毒症ALI模型，并通过检测小鼠肺功能验证建模成功。本研究中，ALI组小鼠肺组织miR-145-5p水平和BALF中TNF-α和IL-6水平均高于对照组，肺组织AMPK蛋白水平低于对照组，且ALI小鼠肺组织中miR-145-5p水平与AMPK蛋白水平呈负相关，与BALF中TNF-α和IL-6水平均呈正相关。miR-145-5p与炎性反应有关，在2型糖尿病中，miR-145水平的升高与慢性炎症反应有关，且miR-145可通过靶向OPG和KLF5调控核因子(NF)-κB的活化，发挥促炎作用[13]。miR-145-5p也可以通过抑制SMAD3的表达使炎性因子的水平升高，从而引起囊性纤维化[14]。这提示miR-145-5p在脓毒症ALI过程中过表达，且促进了炎性反应。

线粒体功能障碍被认为是脓毒症相关器官衰竭的重要原因，AMPK是细胞能量状态的重要传感器，可调控线粒体功能，从而改善细胞的能量利用[15]。此外，AMPK还有助于激活自噬。自噬是一种高度保守的分解代谢过程，可降解和回收损伤的细胞质成分，包括大分子蛋白和细胞器[16]。细胞的自噬可以缓解炎性反应，在LPS引起的肺损伤小鼠模型中，炎性因子水平升高与自噬水平降低有关[17]。Lei等[18]研究认为自噬水平与炎性因子IL-33相关，提示在ALI中自噬和炎性反应具有相互调节作用。本研究中，ALI小鼠肺组织AMPK蛋白水平明显降低，且与miR-145-5p呈负相关。而在人和小鼠中，miR-145-5p与AMPK mRNA的3’UTR的结合位点具有保守性，并在人肺上皮细胞中验证了miR-145-5p可通过靶向抑制AMPK蛋白的表达水平。Wang等[19]的研究结果显示，促进AMPK-过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)途径的激活可改善LPS诱导的ALI。也有研究结果显示，罗格列酮通过激活AMPK-PPARγ依赖性信号通路减轻ALI小鼠模型的肺水肿[20]。以上结果均提示AMPK的抑制与脓毒症ALI有关，而AMPK水平受miR-145-5p的靶向调控。

综上所述，在脓毒症ALI小鼠模型中，miR-145-5p的升高与炎性反应有关，且miR-145-5p可能通过靶向抑制AMPK的水平调节炎性反应，参与脓毒症引起的ALI，这可能成为治疗ALI的新靶点。miR-145-5p/AMPK在脓毒症ALI中的作用机制值得深入探讨。