福建省猪圆环病毒4型PCR检测及全基因组序列分析

刘建奎，李 娜，吴熠丹，邓小莺，毛 婉，黄晓紫，张焦杰，黄夏玲，魏春华

(龙岩学院生命科学学院/福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室/福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩 364000)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)根据其抗原性和基因组特性分为猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)和2016年新发的猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)3个型[1-4]。PCV1对猪无致病性，而PCV2是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原，是当今危害世界养猪业最严重的病毒之一，给世界养猪业带来了严重的经济损失[5-8]。研究表明，PCV3在猪场普遍存在，可能与呼吸系统疾病和母猪繁殖障碍有关[3-4]。2019年，我国学者从临床表现呼吸道疾病、肠道疾病和猪皮炎肾病综合征(PDNS)的猪中发现了一种新型的圆环病毒，命名为猪圆环病毒4型(PCV4)，引起了国内学者的高度重视[9]。

PCV4基因组全长为1 770 bp，包含2个主要开放阅读框(ORF)，即ORF1和ORF2，分别编码Rep蛋白和Cap蛋白。序列分析表明，PCV4与PCV1、PCV2及PCV3代表性毒株的核苷酸同源性仅为50%左右，而与水貂圆环病毒同源性较高，约为67%[9]。研究人员推测，PCV4可能与呼吸道症状、肠道症状及PDNS存在一定关联[9-10]。福建省是我国养猪大省，为了解福建省规模化猪场PCV4的感染和流行情况，本研究收集具有PMWS症状的发病猪组织病料或血清200份，进行流行病学调查及PCV4全基因组克隆，探求其分子流行特征，为该病毒的后续研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2018年10月至2019年12月采集福建省龙岩市、漳州市、莆田市、泉州市等多个规模化猪场200份表现为进行性消瘦、皮肤苍白或黄疸、呼吸急促等疑似PMWS发病猪的临床样品，包括脾脏和肾脏等病料和血清等，置-80℃冰箱保存备用。

将采集的组织病料和无菌PBS按1∶5比例充分研磨后反复冻融3次，4℃、10 000 r/min离心5 min，取上清，置-80℃保存备用。血液样品4℃、4 000 r/min离心10 min，分离血清，置-80℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase，南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品；pEASY-Blunt克隆载体，北京全式金生物技术有限公司产品；DNA Marker DL 2 000、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，Takara公司产品；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技有限公司产品。

1.1.3 引物 参照文献[9]方法合成鉴定PCV4的荧光定量PCR检测引物及探针和扩增PCV4基因全长的引物，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.4 主要仪器设备 台式高速冷冻离心机(CL31R)、梯度PCR仪(ProFlex)、荧光定量PCR仪(Stepone Plus)，Thermo Fisher Scientific公司产品；凝胶成像系统(GeL Doc TMXR)，美国Bio-Rad公司产品；电泳仪(DYY-2C)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 无菌采集发病猪的脾脏、淋巴结和肾脏等组织样品和血清，按照Takara公司的DNA试剂盒说明书提取DNA，置-20℃保存备用。

1.2.2 PCV4检测及PCR扩增 应用荧光定量PCR检测方法对提取样品的DNA进行PCV4检测。将通过荧光定量PCR检测为阳性的样品，进行PCR扩增。PCR体系：ddH2O 7.0 μL，PCR buffer 12.5 μL，DNA 2.0 μL，10 mmol/L dNTP mixture 1 μL，上、下游引物各1.0 μL，酶 0.5 μL，总体系25 μL。PCR仪程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s,57℃ 45 s,72℃ 2 min,72℃ 10 min;35个循环。同时按照PCV2荧光定量PCR检测试剂盒操作说明对样品DNA进行PCV2检测。

1.2.3 测序与分析 目的基因经胶回收后连接至pMD19-T载体中，构建重组质粒，转化至DH5α中，将阳性菌液送睿博兴科生物技术有限公司测序。利用Mega6.0和DNA Star软件对测序结果进行比对分析。本研究序列比对所用的毒株信息见表1。

表1 本研究使用的毒株信息

2 结果

2.1 PCV4检测结果

利用荧光定量PCR检测方法对200份样品进行检测，结果表明福建省猪场PCV2感染率为68%，而PCV4的感染率仅为2%(4/200)，PCV2和PCV4共感染率为1%(2/200)。为进一步研究PCV4分子特征，对4份阳性样品进行PCR扩增，结果表明只有1份样品为阳性，扩增后片段与目的片段大小一致，约为1 700 bp(图1)。

M.DNA标准DL 2 000；1.FJ-PCV4；2.阴性对照

2.2 PCV4全基因组及ORF2序列分析

测序结果表明，FJ-PCV4(登录号：MT721742)的全基因组长度为1 770 bp，与NCBI发表的PCV4参考毒株PCV-VIRES-NX01-G28、HNU-AHG1-2019的核苷酸同源性为98.8%～99.2%，与PCV2(PCV2a-PCV2e)代表毒株AF055392-PCV2a、AF055394、DK1980PMWSfree、BDH等同源性为50.7%～52.0%，与PCV3代表毒株MN2016和MO2015同源性为43.3%～43.4%，与PCV1代表毒株同源性为51.2%，而与水貂圆环病毒代表毒株Mink circovirus strain SD16、Mink circovirus strain MiCV-DL13同源性为68.1%～68.2%(图2)。

图2 FJ-PCV4全基因组与参考毒株核苷酸同源性比较

FJ-PCV4 ORF2基因全长为687 bp，编码228 aa，与GenBank发表的PCV4参考毒株PCV-VIRES-NX01-G28、HNU-AHG1-2019的核苷酸和氨基酸的同源性分别为90.0%～99.4%和98.7%～99.1%，与PCV2(PCV2a-PCV2e)代表毒株AF055392-PCV2a、AF055394、DK1980PMWSfree、BDH等核苷酸和氨基酸的同源性分别为49.1%～51.6%和43.8%～46.4%，与PCV3代表毒株MN2016和MO2015核苷酸和氨基酸的同源性分别为39.8%～40.0%和25.2%，与PCV1代表毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为为48.8%和43.5%，而与貂圆环病毒代表毒株Mink circovirus strain SD16、Mink circovirus strain MiCV-DL13核苷酸和氨基酸同源性分别为62.3%～62.6%和70.6%(图3和图4)。

图3 FJ-PCV4 ORF2基因与参考毒株核苷酸同源性比较

图4 FJ-PCV4 Cap蛋白与参考毒株氨基酸同源性比较

2.3 FJ-PCV4全基因组及ORF2遗传进化分析

为了研究PCV4毒株与国内外已发表毒株的遗传特性和亲缘关系，利用Mega6.0分子生物学分析软件对PCV4毒株和已知的参考毒株绘制遗传进化树。遗传进化树分析结果表明，FJ-PCV4毒株与PCV-VIRES-NX01-G28、HNU-AHG1-2019亲缘关系较为密切，处于同一进化分支；FJ-PCV4、PCV-VIRES-NX01-G28及HNU-AHG1-2019毒株与水貂圆环病毒(Mink circovirus strain MiCV-DL13、Mink circovirus strain SD16)及蝙蝠相关的圆环病毒(Bat associated circovirus 1 isolate XOR)毒株亲缘关系较近，处于同一大进化分支。而FJ-PCV4毒株与PCV1、PCV2、PCV3参考毒株的亲缘关系较远，处于不同进化分支(图5)。通过对PCV4Cap基因和参考毒株序列进行序列比对分析，构建的系统进化树分析结果与全基因组构建的遗传进化树结果相似(图6)。

图5 FJ-PCV4和参考毒株全基因系统进化树分析

图6 FJ-PCV4和参考毒株ORF2基因系统进化树分析

3 讨论

猪圆环病毒(PCV)是单股环状的DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有3个基因型的PCV，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1对猪只无致病性，PCV2是猪圆环病毒相关病(PCVAD)的主要病原给世界养猪业造成了巨大的经济损失[6-8,11]，2016年出现了可能与PDNS和猪繁殖障碍等疾病相关新型猪圆环病毒PCV3，流行病学调查发现，目前猪场感染PCV3也较为普遍[12-17]。2019年，我国学者从湖南省发病猪群第发现了新型猪圆环病毒(PCV4)，根据国际病毒分类委员会命名原则，圆环病毒属的成员在基因组核苷酸同源性应在75%以上[18]。通过对PCV4的序列进行分析表明PCV4与水貂圆环病毒的核苷酸序同源性最高(66.9%)，与其他PCV基因组的核苷酸同源性较低(43.2%～51.5%)， 因此PCV4为猪圆环病毒属中的新成员[9]。

养猪业是福建省重要的经济支柱，为了解PCV4在福建省规模化猪场的流行情况，本研究通过收集2018年-2019年猪场疑似PMWS的200份临床样本进PCV4检测，结果表明PCV4虽然已经在福建省出现，但是猪场感染率很低，约为2%。此外，本研究通过临床阳性样本，顺利地扩增出1株PCV4全基因组序列。序列分析表明PCV4全基因组大小为1 770 bp，与参考毒株PCV-VIRES-NX01-G28、HNU-AHG1-2019的核苷酸序列同源性为98.8%～99.2%，与PCV1、PCV2及PCV3的代表毒株核苷酸序列的同源性仅为43.3%～52.0%，而与水貂圆环病毒(Mink circovirus strain MiCV-DL13、Mink circovirus strain SD16)及蝙蝠相关的圆环病毒(Bat associated circovirus 1 isolate XOR)核苷酸序列进行比较分析，发现其同源性高达65.2%～68.3%，与之前报道的结果相似[9]。全基因组和ORF2遗传进化树表明PCV4与PCV1、PCV2以及PCV3代表毒株亲缘关系较远，而与水貂圆环病毒(Mink circovirus strain MiCV-DL13、Mink circovirus strain SD16)及蝙蝠相关的圆环病毒(Bat associated circovirus 1 isolate XOR)毒株亲缘关系较为密切，处于同一大进化分支，进一步证实PCV4为新型的圆环病毒。病毒株是否会对猪产生致病性需要进一步研究。此外，本研究在200份疑似PMWS症状的猪组织病料和血清样品中，PCV2检出率为68%(136/200)，而PCV4的检出率仅为2%(4/200)，2份阳性病例为PCV2和PCV4共感染，表明 PCV4可能引起PMWS和PDNS，这需要通过动物试验进一步深入研究[9-10]。

综上所述，虽然目前在福建省猪场内PCV4的感染率比较低，但应该对PCV4的流行动态进行严密的监视，做出相应的防控措施。