Ⅰ群血清11型禽腺病毒的分离鉴定与遗传进化分析

张宇龙，刘红祥，滕巧泱，许春雨，马 冬，钟 声，杨少艳，高天佐，于 静，宋姗姗，孔宪好，袁 飞，刘 东，李雪松

（1.青岛易邦生物工程有限公司，青岛 266114；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAdV）属于腺病毒科禽腺病毒属，是无囊膜的双股DNA病毒[1]。根据其群特异性抗原的不同，可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群[2]。禽腺病毒根据交叉中和试验可分为12个血清型[3]，鸡、鸭、鹅及其他禽类均可感染。有研究通过对2007—2014年家禽分离的若干株禽腺病毒进行hexon基因序列分析，得出FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-l1为我国禽腺病毒主要的流行血清型[4]。大部分毒株会造成包涵体肝炎，剖检肝脏黄染、肿大、表面有密集的小出血点或出血斑，部分毒株还会有心包积液的症状[5-7]。之前在我国很少见该病发生与流行的报道。自2015年6月份以来，该病在国内大面积流行，主要集中在山东省、河南省、河北省、辽宁省、安徽省、吉林省的部分地区[8]。该病主要发生于3～5周龄肉鸡，也可见于杂交鸡、麻鸡、种鸡和蛋鸡，肉鸭也可以发生，死亡率高达10%～40%。鸡感染后可成为终身带毒者，既可垂直传播，又可水平传播，并间歇性排毒，因此该病是目前国内养殖户最为关注的疫病之一。

2018年9月初，山东省临沂市某肉鸡场30日龄的白羽肉鸡暴发了一种死亡率高、发病急的疫病，发病初期鸡只精神萎靡、嗜睡、食欲降低、呈卷曲姿势、羽毛粗乱，鸡群还存在拉稀现象，发病后很快出现急性死亡并引发较高死淘率。本研究从临床采集发病鸡的肝脏、脾脏等病料组织病料中分离到1株病毒，并对分离株进行鉴定、分析，最后确诊此次疫病病原为禽腺病毒Ⅰ群，基因型为D型，血清型为11型（D11型）。

1 材料与方法

1.1 试验材料山东省临沂市某肉鸡场送检的疑似禽腺病毒感染的白羽肉鸡。

1.2 主要材料与试剂PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司。根据GenBank中已有的FAdV Hexon基因序列，利用Primer Premier 6.0软件设计合成了1对特异性引物，引物序列FADV-F:CAARTTCAGRCAGACGGT，FADV-R:TAGTGATGMCGSGACATCAT；扩增片段为890 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用DEPC水溶解并配成20 pmol/mL溶液备用。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物有限公司。标准Ⅰ群腺病毒阳性血清及抗原由本公司提供。

1.3 样品的处理剖检观察病理变化，并取症状明显的病鸡的肝脏剪碎后以1∶4的比例加入含1%双抗的生理盐水研磨。-40℃反复冻融3次，4℃、7000 ×g离心l0 min，取上清液无菌过滤后备用，将其命名为YB7288。

1.4 常见病PCR检测用实验室禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒引物进行RT-PCR，检测上述1.2处理好的样品YB7288，确定是否有其他病毒感染。

1.5 血清学检测取上述1.2中制备的上清液与标准I群腺病毒阳性血清进行琼脂扩散试验，设置阳性、阴性对照。湿盒中37℃孵育72 h，观察结果。

1.6 病毒分离取上述1.2制备的上清液通过卵黄囊接种7日胚龄SPF鸡胚10枚，0.2 mL/枚。置于37℃下孵育，每天照胚4次，弃除24 h内死亡的鸡胚。对24 h后死亡的鸡胚进行解剖，观察病变。收取死亡鸡胚的尿囊液、卵黄及胚体，以1∶4的比例加入含1%双抗的生理盐水研磨。-40℃反复冻融3次，4℃、7000 ×g离心l0 min，取上清液无菌过滤后备用，将其命名为YB7288F1。

1.7 血凝（Hemagglutination，HA）试验 分别取上述1.3中的上清液，按照现行《中国兽药典》附录中的“血凝（HA）试验”，分别对鸡、鸭的l%红细胞悬液进行血凝（HA）试验，观察上清液能否对动物红细胞产生凝集现象。

1.8 hexon基因扩增反应体系（50 μL）：模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.75 μL，酶1 μL，10×Buffer 5 μL，2×Buffer 25 μL，灭菌ddH2O 16.5 μL。PCR反应条件为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸1 min，共33个循环；72℃再延伸5 min。PCR结束后，取7 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.9 目的基因同源性比对及分析测序结果利用DNAStar和MEGA6.0软件进行比对分析，绘制系统进化树，并进行分析。

表1 FAdV参考毒株名称及登录号Table 1 Name and accession number of FAdV reference strains

2 结果

2.1 解剖病理情况病鸡出现大量心包积液（图1A），肝脏出现大小不等的出血斑，肝脏颜色变浅（图1B）；病鸡肾脏充血，出血，肿大（图1C）。

图1 不同器官病理变化Fig.1 The pathological changes of different organs

2.2 血清学检测经过72 h后，在琼脂板中观察实验结果。待检样品YB7288与D11标准阳性血清间产生沉淀线，呈阳性反应，与C4标准阳性血清和8b标准阳性血清间无沉淀产生，为阴性反应，且阴性、阳性对照成立（表2）。

表2 琼脂扩散结果表Table 2 Result of agar-gel precipitation (AGP) Test

2.3 血凝（HA）试验对YB7288病毒分离株进行血凝（HA）试验，检测结果显示鸡、鸭1%红细胞悬液均呈现下滑，故其对鸡、鸭的l%红细胞悬液均无血凝活性。

2.4 病毒分离将病料样品过滤后，经卵黄囊接种鸡胚2 d开始死亡，鸡胚死亡时间为48～133 h，死亡鸡胚的病变主要表现为接种鸡胚后48 h鸡胚活力减弱，胚体发育不良，皮肤潮红有出血点（图2A）。绒毛尿囊膜有不同程度的增厚，呈灰白色。肝脏肿大，有的表面见灰白色坏死斑（图2B）。

图2 病料接种鸡胚的病变Fig.2 Lesion of chicken embryo inoculated with the sample

2.5 鸡常见病毒性疾病PCR结果使用Primer Premier 6.0设计禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的引物，经RT-PCR检测结果显示，禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒均为阴性。

2.6 hexon基因PCR结果以分离病毒基因组为模板，PCR扩增病毒hexon基因后，经琼脂糖电泳得到约890 bp的条带，与预期结果相一致（见图3）。

图3 YB7288病毒分离株hexon基因PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification of YB7288 virus isolate hexon gene

2.7 hexon基因同源性分析将测序得到的hexon基因序列与GenBank中的FAdV各个基因型序列以及分离自山东的基因型为D型的序列进行同源性对比，分离株的基因型为D型，血清型为11型。如图4所示，分离株与分离自山东的FAdV株的核苷酸序列相似性最高，达到了100%。

图4 FAdV hexon基因核苷酸序列同源性比较（%）Fig.4 Homology analysis of nucleotides of hexon gene of FAdVs (%)

2.8 hexon基因系统进化分析使用MEGA6.0和DNAStar软件对分离株hexon基因序列建立基因进化树，根据FAdV的基因型将其进行分组。从进化树结构可以看到本试验的19株（1个分离株序列和18个参考株序列）hexon序列按照基因型划分为5个种（A种、B种、C种、D种和E种），具有明显的基因多样性（图5）。从进化树分支和遗传距离可以看出，本试验分离毒株为禽腺病毒D种11型。

图5 FAdV hexon基因进化树Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on Hexon gene of FAdVs

3 讨论

近年来我国禽腺病毒感染率一直在逐年上升，据以往报道，各个血清型中感染率最高的为C4型和8b型。C4型主要造成心包积水综合征，8b型为包涵体肝炎的主要病因。包涵体肝炎主要的病变是肝脏颜色变浅、质脆、肿胀，表面有密集的小出血点或大小不等的出血斑，严重者可见灰黄色坏死灶。在此次山东临沂某养殖场送检病例剖解中，心包中发现有大量淡黄色清亮积液，肝脏质脆、肿大且颜色变浅、发黄，个别有肝脏出血斑，肾脏肿大并伴有充血症状，可见禽腺病毒D11型发病后症状与C4、8b症状相似，会造成心包积液和包涵体肝炎的症状。在此之前我国少有禽腺病毒D11型感染的报道，此次疫病的发生，说明在我国部分地区还存在D11型毒株的流行。

通过本次病例可见，Ⅰ群禽腺病毒D11与C4、8b一样对家禽养殖业具有较大威胁。目前禽腺病毒感染尚无特效治疗药物，其综合防控措施主要以疫苗免疫接种和加强饲养管理为主。免疫程序一般为7～9日龄首免，30日龄前后进行二免，肌肉注射0.3～0.5 mL/只。做琼扩试验结果表明，D11与C4、8b型之间几乎不存在或存在很小一部分交叉保护，所以在白羽肉鸡养殖场尽量选用含有C4、8b和D11毒株的疫苗进行免疫。鸡群还应做好免疫抑制病的防控，特别是传染性法氏囊、传染性贫血综合征等，这些疾病均可导致腺病毒的继发感染[9]。

鸡舍发生禽腺病毒感染很大的一部分原因都是由饲养管理不到位、养殖密度过大、通风不良、饲料营养不均衡等原因造成的。因此，应同时改善鸡只饲养管理条件，防止冷应激和热应激，合理控制养殖密度，饲料中适量添加维生素和矿物质，保证饮水安全卫生，发病鸡要及时隔离饲养，避免造成水平传播感染。