含缬酪肽蛋白促进IBV的胞内运输

袁 晓，王 欢，丁 铲，廖 瑛

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

VCP（Valosin-containing protein），即含缬酪肽蛋白，是三磷酸腺苷酶超家族中的一员，在不同物种中具有高度的同源性[1-2]。VCP参与蛋白降解、膜融合、DNA修复与复制、调控细胞周期，激活NF-κB信号通路等生理活动，并具有抗细胞凋亡、启动转录因子及参与细胞内吞等作用[3]。已有文献报道，VCP与内吞小体复合物相结合，在膜融合和囊泡转运过程中发挥着重要作用[4]。干扰VCP的表达导致内吞小体体积增大，不能成熟[5]。

禽传染性支气管炎（avian infectious bronchitis，IB）是鸡群的急性、高度接触性的传染性疾病，由禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）感染引起，属于禽类的四大病毒性疾病之一，给养禽业带来了巨大的经济损失[6-7]。研究发现，IBV发生感染和进入宿主细胞时，依赖网格蛋白内吞方式进入细胞，依次通过早期内体、晚期内体、溶酶体，在酸性环境中发生膜融合，释放病毒基因组进入细胞质[8]。因此，内体的成熟在IBV的感染中起到重要的作用。已有研究表明：干扰VCP的表达，导致入胞的IBV滞留在早期内体，不利于IBV的复制和增殖[4]。本研究通过干扰或外源表达VCP，检测IBV的基因组复制水平和蛋白表达水平，并检测VCP的亚细胞位置，进一步证实VCP在IBV感染和增殖中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和试剂IBV（Beaudette株）由华南农业大学刘定祥实验室赠予；Vero细胞和HeLa细胞由本实验室保存；siRNA购自吉玛生物公司；VCP抗体和β-actin抗体购自CST公司；IBV-N蛋白抗体由刘定祥实验室赠予；Rab5、Rab7、LAMP1抗体购自CST公司；FuGENE转染试剂购自Promega公司；Lipofectamine 2000购自赛默飞公司；GFP-VCP质粒由本实验室构建。

1.2 siRNA干扰和病毒感染将Vero细胞计数，并按照5×105/孔的细胞数接种至6孔板。siRNA的转染按照Lipofectamine 2000说明书进行操作。48 h后，接种IBV（MOI=1），感染后12 h收取样品，通过Western blot检测病毒蛋白的表达水平，荧光定量RT-PCR检测病毒RNA的复制水平。siVCP-F：5'-AAGUAGGGUAUGAUGACAUUG-3'，siVCP-R：5'-CAAUGUCAU- CAUACCCUACUU-3'。

1.3 GFP-VCP的构建对VCP（GenBank登录号：AB232593.1）全基因进行克隆。PCR产物经测序正确后，将其连接至真核表达载体pEGFP-N1中，获得重组表达质粒pEGFP-N1-VCP。VCP-F：5'-CC CAAGCTTGCCACCATGATTCGGCTCTTCTCGGCT-3'；VCP-R：5'-CGGGGTACCCGAGCGGTGGCAAGCG AC-3'。

1.4 质粒转染和病毒感染将Vero细胞计数，并按照5×105/孔的细胞数接种至6孔板。GFP-VCP质粒的转染按照FuGENE的说明书进行操作。转染后36 h接种病毒（MOI=1），感染后12 h收取样品，通过Western blot检测病毒蛋白的表达水平，荧光定量RT-PCR检测病毒RNA的复制水平。

1.5 SDS-PAGE和Western blot将蛋白样品12 000 ×g离心10 min，取10 μL上样，80 V恒压电泳30 min后，120 V恒压电泳100 min。将蛋白胶与海绵、滤纸、PVDF膜按照“胶正膜负”的方式排成转印用的“三明治结构”，250 mA恒流转印90 min。5%脱脂乳室温封闭PVDF膜2 h，依次孵育一抗和二抗各1 h，分别用TBST清洗3遍。将PVDF膜在ECL发光显色液中孵育20 s，在全自动化学发光图像分析系统（上海天能公司）上检测蛋白表达信号。

1.6 RNA抽提和荧光定量RT-PCR往6孔板的每孔中加入1 mL TRIzol试剂，室温静置5 min，待细胞完全裂解后，将裂解液转移至无RNA酶EP管中；向EP管中加入200 µL氯仿，震荡15 s，室温静置5～10 min；4℃、12 000 ×g离心15 min，将上层水相转移到新的无RNA酶EP管中，再加入等量异丙醇，-20℃沉淀RNA 1 h或者更长时间；4℃、12 000 ×g离心20 min，弃去上清液；加入1 mL的75%乙醇，4℃、12 000 ×g离心10 min，弃去上清液；在超净台中，风干RNA沉淀物，加入30 µL的DEPC水，使其充分溶解，然后用微量核酸蛋白测定仪NanoDrop 2000c分光光度计测定RNA浓度。

根据测定的RNA浓度，取2 µg RNA，用DEPC水补足至33.5 µL，加入2 µL引物18T，或病毒基因特异性引物R-gRNA（+），或病毒基因特异性引物R-gRNA（-），70℃水浴10 min，再迅速转移至冰上3～5 min。按照表1所示的50 µL反转录体系加缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂和反转录酶置于42℃反转录2 h。将RNA反转为cDNA后，置于75℃灭活5 min，储存于-20℃，备用。反转录体系为：2 µg DEPC水和RNA，2 µL的18T随机引物特异性引物R-gRNA（+）或R-gRNA（-），10 µL的5×反转录缓冲液，2 µL的dNTP，1 µL的RNA酶抑制剂。以cDNA为模板，采用SYBR Green染料法进行PCR测定。按荧光定量RT-PCR反应体系，在实时定量PCR仪器设置如下反应程序：94℃预变性3 min，94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40个循环。通过溶解曲线分析，采用2-ΔΔCT法计算目的基因RNA相对表达量，内参基因采用β-actin，引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.7 间接免疫荧光实验以pEGFP-N1-VCP质粒转染Vero细胞24 h，以1 MOI IBV感染细胞。分别在感染后0 h、1 h、2 h，每孔加入1 mL新鲜配制的5%多聚甲醛，室温固定10 min，预冷的TBST清洗3遍；每孔加入1 mL含有5%BSA的TBST溶液，37℃封闭30 min，TBST清洗3遍；分别孵育Rab5、Rab7和LAMP1抗体1 h，TBST清洗3遍，然后避光孵育带有荧光二抗1 h，TBST清洗3遍，孵育DAPI稀释液5 min左右，TBST清洗3遍。取出盖玻片倒扣在滴有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，避光风干过夜后放4℃保存，通过蔡司激光共聚焦显微镜避光观察和成像。

2 结果

2.1 干扰VCP的表达不利于病毒的增殖转染siRNA干扰VCP的表达，36 h后接种IBV。感染12 h后收取细胞样品，通过Western blot检测VCP的干扰效果和IBV N蛋白的表达。与sic对照组相比较，siVCP成功地干扰了VCP的表达；病毒蛋白IBV-N的表达水平在干扰VCP的细胞中略有减少（图1A），揭示干扰VCP的表达，不利于IBV的增殖。进一步检测IBV RNA水平，发现病毒的正链RNA和负链RNA在干扰VCP的细胞中均有下降（图B）。以上结果证实VCP能够促进病毒的复制。

图1 干扰VCP对IBV增殖的影响Fig.1 siVCP affect the IBV replication

2.2 外源表达VCP促进IBV增殖以GFP-VCP转染Vero细胞，24 h后以1 MOI IBV感染细胞，12 h后收取样品，检测病毒N蛋白的表达水平和基因组RNA复制水平。与表达GFP的对照组相比较，外源表达GFP-VCP明显促进IBV-N蛋白的表达和病毒基因组RNA复制（图2A、2B），证实VCP有助于病毒的复制和增殖。在感染后2 h检测进入细胞的病毒基因组，则发现病毒的内吞不受VCP表达水平的影响，说明VCP在病毒内吞后促进病毒的感染（图2C）。

图2 过表达GFP-VCP对IBV感染的影响Fig.2 Overexpression of the GFP-VCP affect the IBV infection

2.3 GFP-VCP与内体标志物Rab5发生共定位IBV发生网格蛋白依赖型内吞后，通过细胞的内体系统进行运输，依次通过早期内体、晚期内体，到达溶酶体[8]。已有报道表明，敲除VCP后导致IBV病毒粒子滞留在早期内体[4]。为了探究VCP在病毒的胞内运输中发挥作用，我们检测了GFP-VCP在病毒入胞过程中的亚细胞定位。以GFP-VCP转染Vero细胞，24 h后以1 MOI的IBV感染细胞，分别在0 h、1 h和2 h收取细胞进行间接免疫荧光实验，检测GFP-VCP跟早期内体标志物Rab5、晚期内体标志物Rab7、溶酶体标志物LAMP1的共定位。结果可知，在感染后0、1、2 h，VCP均与早期内体标志物Rab5共定位，不跟晚期内体标志物Rab7或溶酶体标志物LAMP1共定位（图3）。以上结果说明：在病毒感染过程中，VCP定位于早期内体，可能参与早期内体的成熟，因而促进IBV从早期内体运输到晚期内体。

图3 GFP-VCP过表达时，与早期内体的定位关系Fig.3 Location between the early endosome and GFP-VCP

3 讨论

VCP能够形成同源六聚体，参与内质网相关的蛋白降解、线粒体相关的蛋白降解和细胞自噬[9]，阻止错误折叠蛋白的累积；在细胞压力解除时，VCP参与应激颗粒小体的解聚和恢复mRNA翻译；在胞内运输系统参与膜融合，促进早期内体的成熟，参与胞内运输。由此可见，VCP是个多功能蛋白。本研究发现：干扰VCP的表达，明显抑制IBV的复制和增殖；过表达VCP蛋白，则促进IBV的增殖，但对IBV的内吞没有明显影响。因此，初步判断VCP在病毒被细胞内吞后发挥作用。进一步实验发现：VCP蛋白在IBV感染过程中定位于早期内体，揭示VCP有可能参与早期内体的成熟，对于依赖早期内体运输的IBV起着促进胞内运输作用，进一步证实了之前的研究结果[4]。VCP是否对依赖于早期内体运输的病毒均有促进作用，还有待于进一步证实。

除了通过促进胞内运输系统的成熟，VCP还有可能通过其他方式促进病毒增殖。例如，VCP促进应激颗粒小体的解聚，能够恢复病毒mRNA的翻译[10]；VCP通过促进RIG-I的降解，负向调控干扰素的表达[11]。前人研究表明，VCP在多种病毒的感染中发挥重要作用：例如，在辛德比斯病毒感染中，VCP能够调控其受体NRAMP2的胞内运输，促进病毒的入胞[12]；在西尼罗河病毒感染过程中，VCP参与病毒生命周期的早期感染步骤和基因组复制过程[13]；在脊髓灰质炎病毒的感染过程中，VCP有可能参与病毒的释放途径。因此，VCP可能在不同病毒的生活周期发挥作用，影响病毒的增殖。