BVDV E2蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

陈昕迪，郝永清

（内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）又称牛病毒性腹泻病毒-粘膜病病毒，与猪瘟病毒、羊边界病病毒同属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）[1]。该病毒可引起牛、猪、羊、鹿等动物患牛病毒性腹泻病[2]。其中，持续性感染、母畜流产和仔猪免疫抑制是该病的主要特征，同时也是预防和治疗的难点[3]。随着规模化养殖和种畜的频繁调运，BVDV的感染趋势迅速上升，这给养牛业带来了重大的经济损失[4]。E2蛋白是BVDV的囊膜糖蛋白，位于病毒粒子的囊膜表面[5]，具有较强的免疫原性，是介导宿主细胞识别、吸附的重要部位。当该病毒侵入机体时，E2蛋白可刺激机体产生中和抗体[6]。本试验分离得到了牛病毒性腹泻病毒（BVDV-1）MCD株，原核表达并纯化E2基因截短蛋白，建立BVDV E2血清抗体间接ELISA检测方法，为进一步研制BVDV检测试剂盒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞及质粒BVDV-1 MCD株、牛肾细胞（madin-darby bovine kidney，MDBK）、pCold TF质粒均由内蒙古农业大学兽医微生物实验室保存。

1.2 主要试剂牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛口蹄疫、牛副结核、布鲁菌病、赤羽病及小反刍兽疫的牛阳性血清均由内蒙古农业大学兽医微生物实验室保存；TOP10感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；DNA胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司；DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司；Ni-IDA蛋白纯化试剂盒、改良型BCA法蛋白质浓度测定试剂盒、ELISA酶标板购自生工生物工程（上海）有限公司；兔抗牛IgG-HRP、兔抗牛IgG-FITC购自Abcam公司；BVDV牛标准阴、阳性血清均购自中国兽药监察所；TMB显色液购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 引物设计根据BVDV-1 MCD株E2蛋白的基因序列（GenBank登录号：AB038020.1），用DNAStar分析E2基因的抗原区、亲水区及表面展示概率，选取主要抗原域，利用Primer Premier 5.0软件设计E2基因的特异性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物5'-GTGGCTCTGGCGGTG GCGGTTCTATGCGGCTGCAGGACT-3'；下游引物5'-CCGCTCGAGTAACATAGGCCCTAATTTATCA TC-3'。

1.4 E2基因的扩增与克隆提取该病毒基因组的总RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix进行反转录，PCR扩增E2的基因，扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性2 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环；72℃再延伸10 min。4℃保存，检验并回收PCR产物。

1.5 E2基因重组表达载体的构建将胶回收的目的片段和pCold TF质粒用KpnⅠ和XhoⅠ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。T4 DNA连接酶连接目的片段和pCold TF质粒，连接产物转化到感受态细胞TOP10中，涂板挑取单菌落并进行PCR鉴定，提取阳性质粒进行双酶切后送至生工生物工程（上海）有限公司测序。

1.6 重组蛋白的表达及纯化将pCold TF-E2转化到BL21感受态细胞中，IPTG 37℃诱导表达，超声波破碎菌体，离心后分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，判定蛋白的表达方式，并利用Ni-IDA蛋白纯化试剂盒进行纯化。

1.7 重组蛋白Western blot检测将纯化过的E2重组蛋白经SDS-PAGE后，转移到PVDF膜，用5%脱脂乳4℃封闭过夜，以牛BVDV阳性血清作为一抗（1∶200稀释），37℃作用1 h，TBST缓冲液洗3～5次，再加入HRP标记的兔抗牛IgG作为二抗（1∶2000稀释）37℃作用1 h，TBST缓冲液洗3～5次后ECL显色。

1.8 间接ELISA检测方法的建立

1.8.1 反应的条件 用正交筛选的方法，分别使用包被液梯度稀释纯化后的E2蛋白8 µg/mL、4 µg/mL、2 µg/mL、1 µg/mL、0.5 µg/mL、0.25 µg/mL包被96孔酶标板，牛BVDV阴性血清和阳性血清分别按1∶200、1∶100、1∶50、1∶25稀释作为一抗，以兔抗牛IgG-HRP分别按1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000作为二抗，以10% PEG4000、5%脱脂乳、5%胎牛血清和1% BSA作为封闭液，37℃条件下反应以确定最佳封闭条件，以及血清、酶标二抗的最佳工作浓度和工作时间，依据P/N值确定ELISA方法的最佳反应条件。

1.8.2 阴性与阳性临界值的确定 取50份牛病毒性腹泻病的阴性血清样品，依据最佳反应条件进行间接ELISA检测，根据OD450值计算平均值和标准偏差SD，根据阴阳判定临界值+3SD确定该ELISA方法的阴阳临界值。

1.8.3 特异性试验 利用已建立的间接ELISA 方法，检测BVDV标准阴、阳性血清和牛传染性鼻气管炎、牛赤羽病、牛口蹄疫、牛副结核、牛布鲁菌病和小反刍兽疫的阳性血清样品，评价该方法的特异性。

1.8.4 敏感性试验 将BVDV阳性血清从1∶2开始依次梯度稀释，依据最佳反应条件进行间接ELISA检测，以确定该ELISA方法的敏感性。

1.8.5 重复性试验 根据以上优化反应条件，利用间接ELISA方法检测5份BVDV阳性血清，每个血清设置5个重复，进行组内重复试验；同时利用不同批次纯化的抗原，检测同一份血清，进行组间重复试验，依据OD450值分析变异系数。

1.8.6 临床样本的检测 利用以上优化条件建立的间接ELISA方法包被E2蛋白对200份临床样本进行检测。IDEXX BVDV总抗体检测试剂盒（货号：99-44000）用于检测大缸奶样或血清中的抗体，评估BVDV是否在牛群中存在。用以上两种方法进行临床样本的检测，测定二者的符合率。

1.8.7 稳定性试验 按照已经建立的间接ELISA方法，取14个包被封闭后的ELISA板，一半置于37℃，另一半置于4℃保存。连续14 d，每天取不同温度的酶标板，其中6列加入BVDV的阴性血清，另外6列加入BVDV阳性血清。比较不同温度下14 d内的OD450值，由此分析本研究建立的ELISA方法的稳定性。

2 结果

2.1 E2基因的扩增以提取的BVDV基因组为模板，利用PCR技术扩增E2基因，电泳后可见一条片段约为722 bp的条带，与预期片段大小一致（图1）。

图1 BVDV E2基因PCR扩增结果Fig.1 PCR product of BVDV E2 gene

2.2 E2基因重组表达载体的构建与鉴定将测序正确的片段与表达载体pCold TF连接，PCR鉴定为阳性的重组质粒pCold TF-E2使用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果显示，得到两条大小为5769 bp和722 bp的片段（图2），均与预期结果一致，说明构建的重组质粒正确。

图2 重组质粒酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.3 E2 重组蛋白的表达优化重组蛋白表达的条件，使用IPTG在37℃恒温震荡培养箱中诱导4 h，将破碎产物的上清液和沉淀分别同时进行凝胶电泳检测，结果显示在82 kDa处，上清液和沉淀均有条带，但上清液中的条带更加清晰且颜色较深，证明该蛋白成功表达且大部分存在于上清液中，为可溶性表达。将获得的重组蛋白命名为rE2。

图3 重组蛋白rE2的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of recombinant protein rE2 by SDS-PAGE

2.4 重组蛋白rE2的纯化利用Ni-IDA蛋白纯化试剂盒进行纯化并获得重组蛋白rE2，经SDS-PAGE电泳鉴定，得到单一的条带（图4），证明获得的重组蛋白rE2纯度较高。

图4 重组蛋白rE2的纯化Fig.4 Purification of recombinant protein rE2

2.5 重组蛋白rE2 Western blot鉴定用诱导表达后的E2蛋白通过SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜后，用抗体小量纯化试剂盒纯化后的牛BVDV阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗牛IgG作为二抗进行Western blot检测。结果显示，重组蛋白可被阳性血清识别，发生特异性反应（图5）。

图5 重组蛋白rE2的 Western blot分析Fig.5 Analysis of recombinant protein rE2 Western blot

2.6 间接ELISA 最佳工作条件的确定

2.6.1 最佳抗原包被浓度及最佳血清稀释倍数的确定通过正交筛选确定最佳抗原包被的浓度和最佳血清稀释倍数。结果显示，当抗原包被浓度为8 µg/mL,一抗的稀释度为1∶100时，阳性血清的OD450值为0.998，阴性血清的OD450值为0.145，P/N值为6.883最为合适（表1）。

表1 矩阵滴定Table 1 Matyix titration

2.6.2 封闭液的确定 通过表2可以看出，当阳性血清OD450值接近于1，P/N值最大为3.433，因此可以确定10% PEG4000为最佳封闭液。

表2 封闭液的确定Table 2 Determination of the blocking buffer

2.6.3 二抗稀释度的确定 用以上优化的反应条件进行间接ELISA检测，结果可知，当二抗稀释度为1∶6000时，P/N值最大为2.488（表3），确定二抗稀释比1∶6000是最佳稀释条件。

表3 二抗稀释度的确定Table 3 Determination of the dilution of second antibody

2.6.4 阴阳临界值判定标准的确定 根据以上最佳反应条件，取50份通过IDEXX抗体检测试剂盒鉴定为阴性血清的样品进行间接ELISA检测。根据阴阳判定临界值+3SD确定临界值为0.33。

2.6.5 特异性试验 利用以上建立的间接ELISA方法，对牛病毒性腹泻病、牛传染性鼻气管炎、布鲁菌病、小反刍兽疫、赤羽病、副结核、口蹄疫等牛常见的传染病阳性血清进行检测，结果见图4，只对牛病毒性腹泻病的血清有较好的反应，对其他血清均无明显反应，表明所建立的该方法有较好的特异性。

表4 特异性试验Table 4 Specific test results

2.6.6 敏感性试验 将BVDV的阳性血清从1∶2开始依次倍比稀释，当血清稀释至1∶4096时仍可判断为阳性，表明所建立的方法具有较高的敏感性（图6）。

图6 敏感性试验结果Fig.6 Sensitivity test results

2.6.7 重复性试验 按照以上建立的实验条件，对5份牛的BVDV阳性血清进行间接ELISA检测，由组间和组内重复试验结果可知，组间和组内的变异系数均小于5%，表明该方法具有较好的重复性（表5）。

表5 E2-ELISA 的重复性试验结果Table 5 Reproducibility test for E2-ELISA

2.6.8 临床样品的检测 采用以上建立的间接ELISA方法对180份血清进行临床样品检测，检出阳性血清158份，阴性血清22份，用IDEXX抗体检测试剂盒检测180份相同的血清样本，结果显示阳性血清167份，阴性血清13份，共同检出阳性血清158份，阴性血清13份，两者的符合率为（158+13）/180=95%（表6）。

表6 E2-ELISA 临床样本检测结果Table 6 Clinical sample test results of E2-ELISA

2.6.9 稳定性试验 比较不同温度下14 d内的OD450值，相对误差均在5%以内，且相对误差较小，证明该方法具有较好的稳定性（表7）。

表7 E2-ELISA 稳定性试验的结果Table 7 Results of the E2-ELISA stability test

3 讨论

牛病毒性腹泻病是牛的常见病，广泛分布于全世界，对养牛业造成了极大的危害，并且在临床上多为持续性感染[7]。持续性感染的动物长期处在免疫耐受状态，体内不会产生特异性抗体，但又终生带毒排毒，这也是致使BVDV长期存在且难以控制的原因[8]。E2是在BVDV结构蛋白中免疫原性最强的糖蛋白，在靠近N末端的一半含有多种依赖构象的抗原决定域，它们的N端伸出病毒囊膜外，这是决定抗原性和与宿主细胞识别的关键部位[9]。此试验成功分离了BVDV，对通过RT-PCR鉴定为阳性的结果测序，将测序结果在BLAST上进行比对，确定该病毒株的基因型为BVDV-1。选取E2蛋白的某一段基因构建重组蛋白，利用牛的BVDV阳性血清进行Western blot鉴定，结果证明该蛋白具有良好的反应原性，可诱导机体产生中和抗体。间接ELISA是血清学检测方法中常用的较为敏感和特异的方法，它成功的关键在于抗原的纯度[10]，去除与试验无关的杂蛋白才能避免假阳性反应的发生。本试验利用Ni-IDA柱纯化的重组蛋白rE2作为间接ELISA试验的包被抗原，以HRP标记的兔抗牛IgG为二抗建立的检测方法检测BVDV抗体，通过试验初步验证了该方法具有良好的敏感性及特异性。IDEXX BVDV总抗体检测试剂盒是一种用于检出血清、血浆和牛奶样品中BVDV抗体的酶联免疫检测产品，可用于实验室检验。用建立的E2-ELISA抗体检测方法和IDEXX ELISA抗体检测试剂盒对180份临床样本进行检测，对比结果可知，二者符合率为95%。通过初步试验验证，本实验建立的BVDV E2蛋白间接ELISA方法敏感、特异、可行，这为进一步研制BVDV检测试剂盒奠定了基础。