布鲁氏菌Omp2b优势T-B联合抗原表位的免疫应答特点研究

李大伟，朱玥洁，霍怡杉,李智伟，江晓明，沙 桐，陈志强，张峰波，丁剑冰

布鲁氏菌是一种引起人兽共患传染病的病原菌，即引起布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)[1-3]，目前已经在《中华人民共和国传染病防治法》把它归类为乙类传染病，与我们熟悉的非典、猪流感、炭疽、艾滋病、狂犬病、乙肝等同属乙类传染病[4]。用于动物的布病减毒疫苗有两种，分别是：A19、S2，但是目前广泛用于布病防控的疫苗也存在一定的缺陷，如不同程度的出现急性布鲁氏菌病或副反应的症状[5]。尽管在布鲁氏菌病防治中疫苗免疫起到了非常重要的作用，但目前全球范围内没有国际上认可的用于人的布病疫苗。Omp2b作为布鲁氏菌外膜蛋白的一员，其具有很好的免疫原性，不但可以激发机体产生细胞免疫而且也可以产生体液免疫，而且可以通过遗传工程技术来表达，通过研究发现布鲁氏菌外膜蛋白Omp2b是一种良好的抗原成分。

本研究采用生物信息学分析方法分析了Omp2b蛋白的结构[6-7]，并预测了T细胞和B细胞的优势表位得到了T-B联合抗原表位：196-216区段，并人工合成肽段，利用合成肽段与布鲁氏菌病患者和健康人群的血清进行免疫反应，通过分析其诱导的体液及细胞免疫应答的效果，研究结果可为进一步研究布鲁氏菌疫苗奠定基础[8]。

1 材料与方法

1.1 研究对象 羊种布鲁氏菌Omp2b(GenBank：AMM72579.1)蛋白氨基酸序列：GenBank中的长度为362 bp的羊种布鲁氏菌Omp2b来源于NCBI网站。收集2017年9月至2019年5月就诊于新疆医科大学第一附属医院感染性疾病中心明确诊断为布病且有详细病历资料的30名慢性布病患者(患者组)和35名健康人(对照组)参加本研究[9]，每1位患者均签署知情同意书，且本研究所有实验均经新疆医科大学第一附属医院伦理学委员会批准(伦审号：20150225-94)。

1.2 方 法

1.2.1 T和B表位预测和分析 我们使用SYFPEITHI(http：//www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitope prediction.htm)和IEDB(http://tools.immuneepitope.org/)来预测OMP2b蛋白的T细胞表位。我们使用HLA-A*1101预测相应的CTL表位，同时选择HLA-DRB1*0701预测Th表位。使用 DNAStar软件和IEDB来预测OMP2b蛋白的B细胞表位。最后通过比较分析确定Omp2b的T、B细胞表位和T-B联合表位。

1.2.2 Omp2b免疫诱导的T细胞免疫应答 ELISPOT平板涂有特异性抗人IFN-γ抗体(人IFN-γ试剂盒，Cat#552138，BD，SanDiego，CA，USA)在PBS中以1∶60稀释过夜，温度为4～8 ℃。将板用PBS洗涤5次，并用含有10%胎牛血清(FCS)(Sigma)的100 μL RPMI1640培养基(Sigma Aldrich，St.Louis，UA)在37 ℃封闭1 h。将PBMC悬浮液(2×105)加入ELISPOT板中。PBMC悬浮液(2×105)和5 μg/mL TB结合的表位肽加入适当的孔中。每个样品有3个重复的孔。仅PBMC加培养基作为阴性对照和PBMC加上植物血凝素(PHA)用作阳性对照。将板在37 ℃、5% CO2下孵育19 h。之后，孵育平板用IFN-γ特异性生物素化抗体和链霉抗生物素蛋白-HRP。最后，使用ELISPOT自动平板读数器(AID Elispot Reader，AID，Germany)计数IFN-γ特异性斑点形成细胞(SFU)。

1.2.3 Omp2b免疫诱导的特异性抗体应答 将合成的T-B联合表位(6 μg/mL)包被在碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中的微孔板上，然后用5%脱脂乳封闭。加入血清样品后，将板在37 ℃下孵育60 min。洗涤板后，以1∶1 000的比例加入HRP标记的小鼠抗人IgG(BD)作为二抗，并在室温下孵育30 min。再次洗涤板后，加入底物溶液，通过酶标仪(PERLONG，DNM-9602，北京，中国)测量OD450和OD620每个孔的值。使用OD值评估 IgG的相对水平。

1.2.4 CTL表位诱导穿孔素和颗粒酶B的分泌 将PBMC悬浮液(2×105)在含有或不含有5 μg/mL肽的CTL表位的96孔板中与含有10%FCS的RPMI1640培养基一起培养。在37 ℃温育3 d后，收集细胞培养物上清液。分别通过ELISA测量分泌的穿孔素(人穿孔素ELISA pro试剂盒，3465-1HP-2，Mabtech，Stockholm，Sweden)和颗粒酶B(人颗粒酶B ELISA开发试剂盒，3485-1H-6，Mabtech，Stockholm，Sweden)。将板用4 μg/mL抗人穿孔素(克隆Pf-80/164)或2 μg/mL粒酶B抗体(克隆GB10)在4 ℃～8 ℃下包被过夜。用PBS洗涤后，用含有0.05%吐温20(Sigma)和0.1%牛血清白蛋白(Sigma)的PBS封闭1 h。分别添加样品和标准品。将板在室温下温育2 h。用PBS洗涤3次后，加入与抗生物素蛋白结合的抗孔蛋白抗体(1 μg/mL;克隆Pf-344)或抗颗粒酶B抗体(1 μg/mL;克隆GB11)并在室温下孵育1 h。洗涤后，加入链霉抗生物素蛋白-HRP并在室温下温育1 h。最后，加入TMB并孵育15 min以进行显色。通过PERLONG DNM-9602在OD450和OD620下测量该板，基于标准曲线确定样品浓度。

2 结 果

2.1 T-B联合优势抗原表位检测 通过生物信息软件对T细胞表位和B细胞表位的综合分析最终筛选出T-B细胞联合优势抗原表位是：196-216(EQGGDNDGGYTGTTNYHIDGY)。

2.2 Omp2b免疫诱导的T细胞免疫应答 为了测试T-B联合表位的免疫原性，将合成的T-B联合表位与PBMC共同培养并进行ELISPOT测试。ELISPOT可以在细胞通过显色反应分泌这种可溶性蛋白质的相应位置显示清晰可辨的斑点，并且可以在显微镜下或通过ELISPOT分析系统直接计数斑点。表明Omp2b可诱导T细胞免疫应答。患者产生IFN-γ的T细胞高于健康对照组(F=25.413,P<0.01)(图1和图2)。

图1 ELISPOT 检测结果

*P<0.05，**P<0.01 SFU：spot forming units

2.3 Omp2b免疫诱导的特异性抗体应答 为了评估T-B联合表位是否具有产生抗体的能力，进行ELISA(见图3)。在布病患者中检测到针对T-B联合的Omp2b蛋白表位肽的特异性IgG，但在健康对照组中未检测到。两组抗体水平有差异统计学意义(F=13.555,P<0.01)。

*P<0.05，**P<0.01

2.4 CTL表位诱导穿孔素和颗粒酶B的分泌 为了进一步探究CTL表位是否可诱导T细胞免疫应答反应，通过ELISA方法检测上清液中的穿孔素和颗粒酶B的浓度(pg/mL)，并与单独加入PBMC的对照孔进行比较。加入CTL肽段的试验孔比不加入肽段的对照孔的颗粒酶B和穿孔素的浓度升高(F=13.653，P<0.01)。这些结果表明，Omp2b蛋白预测的CTL表位在刺激T细胞产生免疫应答方面是有效的(图4)。

*P<0.05，**P<0.01

3 讨 论

开发预防布鲁氏菌病的有效疫苗尤为重要。有效的疫苗受许多因素的影响，包括蛋白质的结构和位置[10]。对一级结构的分析发现，Omp2b是稳定的蛋白质，有利于疫苗的构建。在蛋白质的二级结构中，β-转角区域和无规卷曲区域有利于形成表位区域[11]。

有效的疫苗不仅应具有合理的蛋白质结构，还应具有有效的T和B细胞表位[12-13]。因此，使用不同的软件分析了Omp2b的T和B细胞表位。T细胞表位必须能够加工成与相应MHC结合的肽，然后被TCR识别[14]。T细胞表位分别由CTL和Th细胞识别的MHC I和MHC II分子呈递。布鲁氏菌是一种细胞内病原体，细胞免疫在去除致病菌方面起着重要作用[15]。使用SYFPEITHI和IEDB来分析Omp2b的T细胞表位[16-17]。选择的HLA分子类型为HLA-A*1101和HLA-DRB1*0701，在新疆人群中频率较高，可用于预测[18-19]。由B细胞产生的特异性抗体可以有效地识别病原体并引发随后的一系列免疫应答。因此，B细胞表位在疫苗开发中起重要作用[20]。利用DNAStar和IEDB软件进行预测。将IEDB的表位预测与亲水性、表面可及性和灵活性的结果相结合，以排除α-螺旋和β-折叠区域中的B细胞表位。亲水、柔性和表面可及的区域通常是形成B细胞表位的主要区域[21]。筛选后，通过生物信息学软件最终筛选得出了1个Omp2b蛋白的T-B联合优势抗原表位：196～216区段(EQGGDNDGGYTGTTNYHIDGY)，T-B联合优势抗原表位可被Th和B细胞识别并激活细胞和体液免疫来消除病原体。

使用ELISA检测患者组和对照组中的特异性抗体，并且在布病患者血清中检测到了针对T-B联合表位肽的特异性抗体。通过研究发现布鲁氏菌的Omp2b可以在布鲁氏菌感染后刺激相应特异性抗体的产生。同时，从患者组和对照组中分离出PBMC，并使用ELISPOT方法检测T-B联合表位肽诱导Th细胞产生免疫应答。结果显示，Omp2b的表位可以诱导IFN-γ的产生，可以诱导Th细胞的免疫应答。

为验证Omp2b的预测CTL表位的免疫反应性，将CTL表位肽与患者的PBMC共培养，并检测上清液中的穿孔素和颗粒酶B水平。CTL细胞通过释放穿孔素和颗粒酶B发挥细胞毒作用。结果显示，加入CTL表位肽后，培养上清液中的穿孔素和颗粒酶B的水平显着增加。因此，CTL的优势表位可以促进穿孔素和颗粒酶B的产生并诱导细胞免疫应答。

综上，通过生物信息学最终筛选出了1个T-B细胞联合优势抗原表位196～216区段。T-B联合优势表位合成的肽段能刺激免疫细胞产生穿孔素、颗粒酶、细胞因子，并能与患者特异性IgG结合，具有良好的免疫反应性，表明T-B联合优势抗原表位能诱导机体产生特异性的细胞和体液免疫应答，为进一步研制布鲁氏菌疫苗提供了实验依据。

利益冲突：无