甘肃省2县犬感染利什曼原虫影响因素分析

李 凡，余大为，杨成明，冯 宇，杨俊克，刘林林，关真平，张永福

内脏利什曼病(visceral leishmaniasis,VL)又称黑热病(kata-azar),是一种通过白蛉叮咬传播的人兽共患的寄生虫病[1-2]。中国的黑热病分为犬源型、人源型和自然疫源型[3-4]，甘肃是犬源型黑热病主要的流行区[5-6]。人和犬的感染是利什曼病犬将利什曼原虫传播给健康的人和犬而导致[7]，人类病例往往集中在犬利什曼病发病率较高的地区[8]，而犬的感染往往先于人的感染[9]。一些国外学者开展了利什曼原虫感染家犬的危险因素研究，但不同地点取得的研究结果差异很大[10]。课题组于2018-2019年在甘肃黑热病流行区开展了以养犬家庭为基础的调查，旨在了解犬源型黑热病流行区犬感染的相关因素，为探讨适合我国犬源型黑热病防控的新方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 调查地点 选取近年来黑热病病例较多的陇南市文县中寨镇兴隆村和甘南州迭部县洛大镇洛大村作为调查现场。2个调查现场均位于河谷，生态环境相似、地理位置封闭，不易受其他村庄流动犬干扰。

1.2 调查方法 采用问卷方式对调查现场所有养犬家庭开展调查，调查犬主的年龄、性别、黑热病防治知识知晓情况等内容，记录犬的位置、犬生活场所周围的房屋条件，犬的来源、犬生活场所附近有无绿植等信息。同时采集受调查家庭犬静脉血5 mL，注入加有乙二胺四乙酸盐(EDTA)的采血管中，充分摇匀后4 ℃冷藏保存。所有受调查的犬主均同意调查资料和犬血液样本在研究中使用。

1.3 检测方法 采用PCR法进行血样检测。试剂盒采用德国Qiagen公司DNeasy Blood &Tissue Kit，按照产品说明书步骤提取DNA。以RV1(5′-CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3′)和RV2(5′-CCACCTGGCCTATTTTACACCA-3′)为引物扩增动基体基因，扩增产物大小145 bp。取5 μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定观察。检测以病原学检测确定的病犬静脉血抽提DNA作为阳性对照，以在非流行区采集的家犬血液样本作为阴性对照。

1.4 统计学分析 采用EpiData3.1建立数据库，采用IBM SPSS 23.0进行统计分析。分类数据采用例数和率[n(%)]描述并采用卡方检验，α=0.05；将检验有意义的变量纳入多元Logistic回归分析，变量的筛选采用条件向后逐步回归法。

2 结 果

2.1 基本情况 中国疾病预防控制信息系统统计结果显示，2009-2017年文县中寨镇共报告黑热病病例27例，迭部县洛大镇共报告26例。兴隆村和洛大村海拔分别为1 400 m、1 680 m；年均温度分别为5～15 ℃、8～11 ℃；人口分别有1 845人和1 640人。在2村共调查养犬户445户，取得调查问卷445份，并采集了537只犬的静脉血。

2.1 PCR检测 对现场采集的537只犬静脉血进行PCR检测，利什曼原虫PCR检测阳性221只，阳性率41.15%(221/537)。其中文县PCR检测阳性率64.63%(95/147)，迭部县PCR检测阳性率32.31%(126/390)。

2.2 调查犬居住环境单因素分析 受调查的537只犬中有283只犬位置分布在村中央，有254只犬位置分布在村边缘，分布在村中央和村边缘的犬阳性率分别为33.92%(96/283)和49.21%(125/254)，两者之间具有统计学差异(χ2=12.923，P<0.05)。379只犬居住场所附近房屋墙面为砖混/粉刷墙壁，158只犬居住场所附近为土坯/石片墙壁，两种条件犬的阳性率分别为30.99%(110/355)和60.99%(111/182)，两者之间具有统计学差异(χ2=44.723，P<0.05)。而犬舍与房屋距离远近、犬只来源方式及犬居住周边环境有无绿植这3种因素与犬阳性率之间无统计学差异，见表1。

表1 犬利什曼原虫感染环境单因素分析

2.3 犬主黑热病防治知晓情况单因素分析 共调查犬主445人，有210人家中存在阳性犬。其中家庭存在阳性犬的犬主中，知晓犬是黑热病传染源的占42.96%(58/135)，不知晓占49.03%(152/310)，两者之间无统计学差异(χ2=1.390，P>0.05)；知晓黑热病传播途径的占为51.43%(72/140)，不知晓占45.25%(138/305)，两者之间无统计学差异(χ2=1.472，P>0.05)；知晓黑热病传播媒介的占42.70%(76/178)，不知晓占50.19%(134/267)，两者之间无统计学差异(χ2=2.405，P>0.05)，见表2。

表2 有阳性犬家庭犬主黑热病防治知晓情况的单因素分析

2.4 犬感染利什曼原虫多因素分析 根据调查犬居住环境和犬主黑热病防治知晓情况单因素分析中χ2检验结果，将具有统计学意义的变量犬的位置、犬舍附近房屋条件纳入多元Logistic回归模型中分析，筛选变量采用向后逐步法，纳入标准为P=0.05，排除标准为P=0.10。拟合结果显示犬的位置、犬主房屋条件被纳入多因素回归模型，见表3。

表3 犬感染利什曼原虫影响因素的Logistic多因素分析

3 讨 论

文县和迭部县是甘肃黑热病主要流行区，两县地处甘肃南部，植被丰富，气候温和，是旅游、商业贸易的重要通道和目的地。黑热病传播季节外来人员多，流动频繁，健康人感染风险很大。因此了解犬源型黑热病流行区犬感染的相关危险因素，有助于减少黑热病的感染和传播。

调查结果显示在村庄边缘位置的犬感染利什曼原虫的风险较高，这可能与当地媒介白蛉习性有关。甘肃本地的黑热病传播媒介中华白蛉具有野栖习性[11-12]，它们主要栖息于野外洞穴，黄昏时飞入村庄内，吸血后再飞回野外。由于白蛉有飞行距离短的特点，使得分布在村庄边缘的犬更容易被白蛉叮咬从而增加感染风险。本调查还发现房屋条件较差的土坯/石片墙壁家庭的犬感染率更高，其感染风险是砖混/粉刷墙壁居住条件犬的2.5倍，分析原因主要是土坯/石片墙壁表面粗糙、遍布孔洞缝隙，为白蛉躲藏和栖息提供良好的场所，增加了白蛉叮咬犬的机会。本次调查未发现阳性犬与周边环境有无较多绿植之间存在相关性，与国外研究证明绿植丰富的环境会增加犬利什曼病感染风险的结果不同[13]，可能与研究地点植物多为果树，村民使用农药喷洒果树有关。本次调查虽然发现阳性犬主对黑热病防治知识的知晓率偏低，但未发现犬主防治知识知晓率与犬阳性率有关。

本次调查的缺憾是没有对媒介白蛉开展密度调查，但根据熊光华研究结果，在甘肃南部白蛉密度随着海拔的增高而递减[14]，低温能够抑制白蛉卵发育，温度对白蛉发育生长和种群分布有很大影响[15]。根据以上研究结果，文县调查点海拔(1 400 m)较迭部县调查点海拔(1 680 m)低，年均温度(5～15 ℃)较迭部县调查点(8～11 ℃)高，更有利于中华白蛉孳生繁育。1999年甘肃省疾控中心曾在迭部洛大村采用灯诱法在居民家开展媒介调查，中华白蛉密度0.5只/h。2006年，顾灯安等在文县中寨采用同样方法开展媒介调查，最多捕获中华白蛉112只，密度14只/h[16]。以上研究资料均表明文县白蛉数量比迭部县多，密度高，因此这可能是文县调查现场犬PCR检测阳性率较迭部县高的主要原因。

综上所述，分布在村边缘、犬居住环境为土坯/石片墙壁是影响犬感染利什曼原虫的因素，这些因素充分说明环境因素在利什曼原虫感染过程中的重要性。针对以上因素，在甘肃省犬源型黑热病流行的地区，要向当地群众宣传黑热病防制知识；督促居住在村边缘的养犬户经常用杀虫剂对犬舍和周边墙壁进行喷洒，重点喷洒土坯/石片墙壁，达到驱避和杀灭白蛉，减少白蛉对犬叮咬的目的；研究表明夏秋季晚间户外活动频率高的居民受感染风险增加[17]，针对外来流动人员要开展预防白蛉叮咬的健康教育，让流动人员夏季晚间外出要穿长袖衣服，涂抹防蚊驱避剂，尽量减少户外活动以避免白蛉叮咬，减少黑热病的传播。

利益冲突：无