盐酸克伦特罗检测方法的建立及应用

李志娟，李洪政＊，付 坤，阎永斌，王永生

（1.河南国康检测技术有限公司，河南 郑州 450003；2.河南中德检测技术有限公司；3.河南农业大学禽病研究所）

盐酸克伦特罗（clenbuterol，CLB），俗称“瘦肉精”，是一类β-肾上腺素受体激动剂化学物质的总称，该物质为白色或类白色的结晶体粉末，味苦，熔点为161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。当瘦肉精进入机体后，导致心血管系统和神经系统运行出现障碍，引起多种心血管和神经系统疾病。动物源性食品中瘦肉精是我国明令禁止的违禁药品。因此，需要加强动物性食品中的瘦肉精的检测，及时发现不合格的肉及肉制品，保障食品安全，对盐酸克伦特罗的有效检测和监控刻不容缓。

目前对盐酸克伦特罗的检测方法有感官检验法、酸碱度法、酶联免疫法（ELISA）、胶体金快速检测卡（DIGFA）、毛细管电泳法（EC）、高效液相法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、金磁纳米粒子高灵敏定量（MGNPs）、中空纤维膜三相液相微萃取法（HF-LLLME）、光声光谱法（PS）、液相芯片技术（LC-chip）等方法，其中朱小艾等采用高效液相色谱法对盐酸克伦特罗的前处理和上机条件进行优化，但与液相色谱-串联质谱法（LC-MS）相比，液质方法耗时更短，定量更准确。俞慧红采用GC-MS的检测方法，但其前处理过程需要通过提取-反萃取-净化-柱后衍生的方式进行，耗时较长。（原）农业部1025号公告-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法》采用了液质的方法，但其前处理过程采用酶解较为复杂。故该研究拟在前人研究的基础上，对样品的前处理过程和上机条件进行优化，旨在为盐酸克伦特罗的检测提供一种简便、快速、准确的定量方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 猪肉、牛肉、羊肉 均采购自菜市场。

1.1.2 盐酸克伦特罗标准品 纯度大于98.0%，德国Dr.EhrenstorferGmbH公司。

1.1.3 乙酸乙酯、氨水、碳酸钠 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.4 甲醇、甲酸、乙腈 色谱纯，sigma。

1.2 主要仪器与设备

1.2.1 液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源） 美国Waters公司Waters TQD。

1.2.2 反向色谱柱 美国WatersUPLCTMBEHC18

（2.1NN 100mm，1.7μm）。

1.2.3 电子天平 BSA2202S-CW，感量0.01g，赛多利斯。

1.2.4 分析天平 BT125D，感量0.00001g，赛多利斯。

1.2.5 氮吹仪 WD1000，杭州瑞诚仪器有限公司。

1.2.6 固相萃取装置 ASE-12/16/24，天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.2.7 高速冷冻离心机 热电ThermoST8ST8R，Thermo Fisher。

1.2.8 恒温振荡水浴摇床 MKY-SPH-110X12，麦科仪（北京）科技有限公司。

1.2.9 涡旋混合器 88882010，ThermoFisher。

1.3 方法

1.3.1 试剂的配制

5%氨化甲醇溶液：量取5mL氨水，加甲醇稀释至100 mL，摇匀即得；0.1%甲酸溶液：量取水100mL，加入0.1mL甲酸，混匀；乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）：量取乙腈5mL，加入0.1%甲酸溶液95mL，混匀；10%碳酸钠水溶液：称量10g碳酸钠，溶于100mL水中，混匀；标准储备液：称取盐酸克伦特罗约10.0mg，置于100mL量瓶内，用甲醇溶解并稀释成浓度为100μg/mL的标准储备液，-20℃冰箱中保存，有效期6个月。混合标准中间工作液：准确量取盐酸克伦特罗标准储备液置100mL量瓶中，用甲醇稀释成浓度为20ng/mL的混合标准中间工作液。-20℃冰箱中保存，有效期6个月。

1.3.2 试样的制备与保存

取适量新鲜的空白样品和采购的10份猪肉、牛肉、羊肉肌肉部分，分别混匀，-20℃以下贮存备用。

1.3.3 质量控制样品的制备

空白样品：取空白试样，与待测试样同步处理。添加样品：取空白试样2i0.02g，添加20ng/mL的标准中间工作液100μL，制得浓度为1μg/kg的阳性添加试样，与待测试样同步处理。

1.3.4 提取

准确称取2i0.02g供试样品于50mL离心管内，加入10%碳酸钠水溶液5mL。加10mL乙酸乙酯提取，涡旋震荡10min，8000r/min离心10min，重复提取一次，合并两次上清液。向合并的上清液中加入0.1mol/L盐酸溶液5mL，涡旋混匀，震荡10min，5000r/min离心5min，重复提取一次，合并两次水相，备用。

1.3.5 净化

混合型阳离子交换固相萃取柱依次用甲醇、一级水各3mL活化；取全部备用液过柱；再依次用一级水、甲醇各3 mL淋洗，减压抽干；用5%氨水甲醇溶液3mL洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹干，残余物用乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）1.0mL溶解，涡旋混匀，取上清液过滤，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.6 系列标准工作液的制备

准确量取盐酸克伦特罗标准溶液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）稀释成浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL的系列标准工作液。

取空白试样2i0.02g于不同离心管中，按1.3.4、1.3.5步骤操作，制得浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL的对照溶液。

1.4 仪器参数与测定

1.4.1 色谱条件优化

色谱柱：WatersUPLCTMBEHC18（2.1NN 100mm，1.7μm）；柱温：40℃；流动相：A-乙腈；B-0.1%甲酸溶液，梯度洗脱，进样量：10μL。

1.4.2 质谱条件

离子源类型：ESI＋；毛细管电压：3.0KV；萃取补偿电压：70V；源温：150℃；雾化温度：450℃；锥孔气流速：150L/hr；雾化气流速：1000L/hr。

1.5 精密度试验

该研究选取多种空白样品进行添加回收率和精密度试验，选取了3种基质猪肉、牛肉、羊肉，按1.3.4和1.3.5步骤操作，添加水平分别为0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg，按该文方法进行前处理和测定，平行测定6次。

1.6 方法应用

随机抽检动物源性食品10份，采用该文建立的方法测定其中盐酸克伦特罗的含量，并采用（原）农业部1025号公告-18-2008进行复测，进行结果比对。

2 结果与分析

2.1 前处理优化结果

该研究采用3种前处理方法处理样品，每种方法优缺点，见表1。

表1 3种样品前处理方法的比较

2.2 色谱条件优化结果

试样开始采用乙腈-水作为流动相，发现响应值较低，在水相中加入0.1%甲酸，可促进其离子化，响应值增高，于是采用0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相。

2.3 标曲溶液稀释液的确定

取阴性空白样，按1.3.4、1.3.5步骤操作，配置一系列基质标准溶液，同时用乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）配置相同浓度的标准工作溶液，上机测定，用上述两套标曲处理同一个加标浓度结果显示，基质标曲溶液处理出来的结果是乙腈-0.1%甲酸溶液配置的标曲处理的105%，说明经前处理，净化程度较高，基质效应影响较小。在后续实验中，可直接采用乙腈-0.1%甲酸溶液配置标曲溶液。

2.4 线性关系、检出限和定量限结果

该研究采用乙腈-0.1%甲酸配置质量浓度0.5～20 ng/mL的盐酸克伦特罗标准溶液，按优化后的液相质谱条件进行测定，线性关系良好，线性方程y=429.858x-53.1756（R2=0.999178），采用标准添加法，以信噪比S/N≥10确定定量限（LOQ）为0.5μg/kg，逐级稀释，以信噪比S/N≥3确定方法检出限0.25μg/kg，依据动物源食品克伦特罗限量标准禁止检出，所以定量限满足要求。其线性回归方程见图1。

图1 盐酸克伦特罗标准曲线线性关系

2.5 添加回收率和精密度试验结果

三种基质中，盐酸克伦特罗的平均回收率80.2%～96.7%，相对偏差（RSD）为0.78～3.1，说明优化的前处理方法所得结果的回收率和精密度满足实验要求，符合定量分析，其回收率和精密度结果详见表2。

表2 盐酸克伦特罗的加标回收率和精密度（n=6）

2.6 方法应用结果

对购买的10份动物源性食品，采用该文建立的方法与（原）农业部1025号公告-18-2008方法同时测定其中盐酸克伦特罗的含量，均为阴性。

3 结论与讨论

该研究建立了一种专门用于动物源性食品中盐酸克仑特罗含量的高效液相色谱-串联质谱检测方法，该研究与朱小艾等所建立的方法比较，液质比液相定量更为准确；与（原）农业部1025号公告-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》相比较，对样品的前处理方法进行优化，不需要酶解过程，前处理时间由22h减少为1h，大大缩短前处理时间且提高了加标回收率，回收率高达80.2%～96.7%。

该研究采用乙腈-0.1%甲酸配置质量浓度0.5～20 ng/mL的盐酸克伦特罗标准溶液，按优化后的液相质谱条件进行测定，线性关系良好，线性方程y=429.858x-53.1756（R2=0.999178），本研究还表明，盐酸克伦特罗的平均回收率为80.2%～96.7%，相对偏差（RSD）为0.78～3.1，说明优化的前处理方法所得结果的回收率和精密度满足实验要求，符合定量分析。

通过对市场上采购的10份动物源性食品羊肉、牛肉、猪肉样品应用该研究所建立的方法进行检测，检测结果与（原）农业部1025号公告-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法》一致，表明所采购的样品均为阴性样品，不含有盐酸克伦特罗成分。

各种结果表明，该研究所建立的方法具有快速、简便、准确的特点，适用于样品数量较大时的快速定量检测，为食品安全监管部门提供了一个快速且准确的定量检测方法。□