人参实时荧光定量PCR 快速鉴别方法

李忠华，杨宝，马宁，岳静怡，郝娟，赵丽红

（1. 太原市食品药品检验所，山西 太原 030031；2. 山西国新晋药集团有限公司，山西 太原 030006）

0 引言

人参为五加科植物人参（Panax ginseng）的干燥根和根茎。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效［1-3］。目前，人参产业发展势头迅猛，人参市场除正品外，尚有代用品、伪品、混淆品，以假乱真的现象屡屡发生，人参饮片市场情况尤其严重，给药用市场管理带来极为不利的影响［4］。因此，急需一种能够快速、准确地鉴别人参的方法，从而确保人参的临床疗效，这对于药品、食品、保健品的质量保障具有十分重要的意义。

DNA 分子鉴定技术因其准确性、客观性，在中药材鉴定中的应用越来越受到人们重视。Shaw 等采用RAPD 法明显地区分开人参属的3 种药材及4种伪品［5］，AP-PCR、PCR-SSCP 法也被应用在人参属药材的鉴定中［6-7］。崔光红等利用多重等位基因特异PCR 鉴别人参、西洋参［8］；王雪松等采用PCRRFLP 鉴定人参真伪［9］；徐凤娇等设计3 条引物多重PCR 方法鉴定人参和西洋参［10］，上述三种方法均需要扩增后电泳，所需检测设备多，检测时间长，电泳毒性大。侯双利等基于β-actin 基因实时荧光定量PCR 鉴别人参真伪。黄林杰等运用qPCR 技术对蕲蛇、浙贝母进行了鉴别研究，该方法采用SYBR Green I 染料，染料毒性大，该方法较Taqman 探针法特异性差，且人参鉴别还需经溶解曲线确定是否为目的产物，检验过程耗时长［11-12］；黄永辉等建立了qPCR 技术鉴别西洋参的方法［13］；吴迪等使用qPCR技术准确地鉴别了紫河车掺伪品中的猪、牛、羊物种［14］。因此从分子生物学准确、快速鉴别中药材的真伪成为研究热点。

实时荧光定量PCR（qPCR）是在定性PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术，具有灵敏度高、定量准确、特异性强、重复性好、无污染等特点，已被广泛用于基因的表达分析。本研究基于人参ITS 序列的特异性位点设计引物，并引入了Taq⁃Man 荧光探针，它是一种寡核苷酸探针，其5′端携带荧光基团，如FAM、HEX 等，3′端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ 等，在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，TaqMan 酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。此方法不仅实现了人参的快速鉴别，还能区分人参和替代品及仿冒品，而且可以对人参样品进行相对定量测定，大大提高了人参鉴别的准确度和灵敏度，为规范人参的市场管理提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

香港力康Neofuge 13R 高速冷冻离心机；eppen⁃dorf 微量核酸分析仪；美国热电ABI7500fast 荧光定量PCR 仪；BIO-RAD C1000 TOUCH 梯 度PCR仪；Power Pac Basic 电泳仪；美国伯乐凝胶成像系统；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0（Tkara，Cat#9765）；上海生工生物公司合成的引物、探针；TaqMan™Fast Uni⁃versal PCR Master Mix（2X）（ABI，NO.4366072）。

共收集人参药材及其易混伪品11 个物种36 份样，样品产地及来源于河北安国、安徽亳州、广西玉林、吉林通化及太原市药店医院和生产企业等地。样品经山西省食品药品检验所主任药师崔宇宏鉴定，保存于太原市食品药品检验所详见表1-表2。

表1 人参样品信息Table 1 Sample information of Panax ginseng

1.2 方法

1.2.1 样品DNA 提取

为了避免污染，样品用体积分数为75%酒精棉球将表面擦拭干净，晾干，干品用球磨仪粉碎成细粉状，鲜品用洁净的剪刀剪碎，混匀，称取20 mg 置于灭菌的2 mL 离心管中。用Tkara 提取试剂盒提取样本DNA，用核酸分析仪测定DNA的纯度及浓度，将OD260/OD280在1.7～1.9 之间，且浓度达到10 ng/μL～100 ng/μL的DNA 溶液作为模板DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 样品DNA 质量确定

按照1.2.1 方法提取人参对照药材（121591-201602）、人参、人参叶及其他中药材样品（见表2）共计13 个样品DNA，水作为空白对照，以13 个样品的DNA 为模板，使用通用引物

表2 其他中药材样品信息Table 2 Sample information of the other Chinese herbal medicine

ITS5F： 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA⁃CAAGG-3′，

ITS4R： 5′-TCCTCCGCTTATTGATAT⁃GC-3′［15］

进行PCR 扩增。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 个循环；72 ℃延伸10 min，观察实验扩增结果。

1.2.3 引物的设计与扩增

引物的设计：通过查阅文献后获得人参、西洋参及其他常见近源物种序列，首先用Snapgene 软件比对出保守序列，再经过Oligov7.0.1 和NCBI 的Primer-Blast，设计出能够用于人参真伪鉴别的实时荧光PCR 检测引物和探针，由上海生工生物公司合成。

正 向 引 物：5′-AGTTGCGCCCGAAGCCAT⁃TA-3′；

反 向 引 物 ： 5′-ATCACTCCTTTGC⁃GGGAGTCGA-3′；

探针：FAM5′-CTATTACCGGAGGGCACA⁃GA-3′TAMRA。

扩增反应体系配制如表3。反应条件为：50 ℃2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40 个循环。

表3 反应体系配制表Table 3 Preparation table of reaction system

1.2.4 特异性实验

将1.2.2 提取的人参样品和其他样品的DNA作为模板。按照上述反应体系和条件进行扩增，以水作为空白对照，验证引物和探针对人参样品扩增的特异性。

1.2.5 样品覆盖度实验

以表1 中34 批人参DNA 为模板，按照1.2.3 进行扩增，以水作为空白对照，进行覆盖度试验。

1.2.6 灵敏度实验

将100 ng 的人参DNA 模板10 倍递减稀释，稀释至10-5，每个梯度做4 个平行实验，按照1.2.3 中反应体系和条件扩增，测试该方法的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 特异性实验样品ITS 片段扩增结果

13 个样品DNA 扩增后的PCR 产物经凝胶电泳均得到700 bp 左右ITS 片段（图1），说明13 个样品均能获得到高质量的DNA。

图1 ITS 片段扩增产物电泳图谱Fig. 1 Electrophoresis pattern of ITS fragment amplified products

M、marker 1、人参对照药材2、人参3、人参叶4、西洋参5、黄芪6、三七7、苦参8、太子参9、玄参、10、桔 梗11、沙 参12、丹 参 13、党 参K、空 白 对 照（ddH2O）

2.2 特异性引物与探针序列

中药基源、近源物种和伪品DNA 序列完全的比较研究是中药DNA 分子鉴别标准中引物设计是否科学的关键［16］。通过对人参、西洋参、三七常见近源物种和伪品序列检索NCBI 的数据库，首先用Snapgene 软件比对出保守序列，再经过Oli⁃gov7.0.1 和NCBI 的Primer-Blast，设计出能够用于人参真伪鉴别的实时荧光PCR 检测引物和探针（见图2），探针序列将测序后获得的发现所有人参与西洋参的5.8S 和ITS2 片段上在位点116、127 处都有2 个碱基的差异，并且所有的人参5.8S 和ITS2 片段上位点116 均为碱基“C”，位点127 均为碱基“T”，而所有西洋参5.8S 和ITS2 片段上位点116 均为碱基“T”，位点127 均为碱基“C”。比对结果同时显示人参与三七在5.8S 和ITS2 片段在112、118、127、130 处有4 个碱基的差异，更容易区别。基于以上差异，设计人参检测特异性探针。

图2 人参、西洋参和三七5.8S 和ITS2 片段上序列的SNP 位点特征Fig. 2 Characteristics of SNP loci on 5.8S and ITS2 fragments of Panax ginseng,P. quinquefolium and P. notoginseng

2.3 特异性实验

图3 为空白对照无FAM 荧光对数扩增曲线；阴性对照非人参类样品无明显的FAM 荧光对数扩增曲线，Ct 值均大于35；阳性对照人参对照药材有FAM 荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值小于35 实验有效。人参、人参叶样品在40 个循环内有FAM 荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值小于35。

图3 人参特异性扩增图谱Fig. 3 Specific amplification map of P. ginseng

2.4 样品覆盖度实验

图4（A）为人参对照药材和20 批人参样品扩增结果，图4（B）为1 批红参、10 批人参粉、2 批人参配方颗粒样品扩增结果，由结果可知，34 批样品在40个循环中均有明显的荧光对数扩增曲线，Ct值均小于35。所以此方法适用于人参药材、饮片、粉、配方颗粒和红参的鉴别。

图4 样品扩增图谱Fig. 4 Amplification map of sample

2.5 灵敏度实验

图5 为样品在稀释度10-5～100时，Ct值均＜35，且曲线有明显的对数增长，扩增结果具有良好的重复性，相对标准偏差RSD 均＜3.5%。以稀释度量值对Ct值作图，其线性关系如图6 所示，线性相关系数R²=0.993，线性方程为y=-3.99×lgx+16.021，线性范围为0.001 ng～100 ng，即1×10-3ng/反应～100 ng/反应，该方法具有良好的线性相关度。本方法灵敏度高达1×10-3ng/反应。

图5 人参样品灵敏度扩增图谱Fig. 5 Sensitivity amplification map of P. ginseng sample

图6 人参样品灵敏度扩增标准曲线Fig. 6 Standard curve of sensitivity amplification of P.ginseng sample

3 讨论

人参质量鉴定方法很多，但有其局限性和专属性。传统鉴别方法往往是通过外观性状，如眼观、手摸、鼻闻、口尝等，必要时借助显微观察和薄层鉴别，这种鉴别方式对检验人员的专业素质要求较高，而且存在主观差别，不适用于快速、准确、广泛的推广。目前光谱法也用于人参的鉴别，且不破坏样品，但必须由经验丰富的实验人员对图谱进行解析［17-18］。而高效液相色谱法操作烦琐、耗时长、检测分析成本较高，且近缘品指标成分相近较难确证［19］。双反应体系测定3 种样品的非线性化学指纹图谱、基于中药质量标志物的超高效液相色谱-串联质谱法近几年也运用于药材和中成药的质量控制［20-21］。现行国家药品标准2015 年版中国药典首次采用PCR-RFLP 方法鉴别川贝母、PCR 方法鉴别乌梢蛇和蕲蛇及金钱白花蛇，也首次制定了中药材DNA 条形码分子鉴定法指导原则，这也是中国中药国家标准划时代迈向分子时代。

ITS 作为真核生物核糖体DNA 的非编码区，承受的选择压力较小，物种间变异较大，遗传信息较丰富，而且长度适宜，有利于后续扩增实验，所以ITS 分子标记被广泛应用于中药材的鉴定。本文依据中国药典2015 年版四部［22］和陈士林对中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则［23］、基于ITS 分子标记，设计了特异性鉴别人参的引物和TaqMan 探针，在40 个循环内人参对照药材、人参药材饮片、人参粉、人参配方颗粒、人参叶、红参有荧光对数扩增曲线，其他非人参样品无荧光对数扩增曲线，整个实验2 h～3 h 左右用时较短；灵敏度较高，达1×10-3ng/反应；整个过程闭管操作，减小了出现假阳性的概率，同时避免了电泳时荧光染料对身体及环境造成损害的可能；人工操作较少，业务不熟练的检验人员也可快速掌握，与形态学生药鉴定结果完全吻合，也验证了实时荧光定量PCR 方法鉴别人参真伪的可靠性和稳定性。

4 结论

本实验建立的引物和TaqMan 探针与模板的特异性PCR 扩增可有效鉴别人参，也可有效区分混淆品和代用品，并且完全闭管检测，无须PCR 后处理，避免了交叉污染和假阳性，实验结果由仪器通过数字方式给出，较为准确，减小了检验人员判读时的主观误差，而且可以实现相对定量；具有准确、快速、灵敏度高、易掌握、便利等特点，作为人参鉴别的新技术，可以在实际应用中推广。