微波辅助三元复合溶剂提取沙棘叶总黄酮的研究

贾晓丽，祝敏，赵三虎

（忻州师范学院 化学系，山西 忻州 034000）

0 引言

沙棘是胡颓子科沙棘属植物，广泛分布于华北、东北、西北及西南等地［1］，沙棘叶中丰富的黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤以及预防心血管疾病等功效［2］。近年来，对沙棘叶总黄酮的提取方法不断有文献报道［3］，史豆豆等将蔗糖酯作为表面活性剂用于沙棘叶黄酮的提取，获得了1.6%的黄酮提取率［4］；赵二劳等将表面活性剂椰子油脂肪酸二乙醇酰胺用于微波辅助提取沙棘叶总黄酮，比仅用微波法提取沙棘叶黄酮的提取率提高了43.8%［5］；孟晓等通过先水提后醇提的两次溶剂提取方法提取沙棘叶总黄酮，在最优条件下，总黄酮得率为8.04%［6］；陈春等利用复合酶结合超声法提取沙棘叶总黄酮，获得了1.78%的提取率［7］；赵芙蓉等利用超声、微波双辅助法提取沙棘叶黄酮，在最佳工艺条件下，测得沙棘叶总黄酮含量为42.75 mg/g［8］。在以上沙棘叶黄酮的提取方法中，乙醇是主要用溶剂。虽然用水做溶剂浸提黄酮类化合物存在绿色环保等优点，应该是最理想的溶剂，但由于其极性大，容易把糖类、蛋白质、无机盐等极性大易溶于水的成分提取出来［9］。所以单一溶剂的使用，受其极性的限制，往往很难满足特定组分的提取，因此，探索一种极性合适、绿色环保的多元复合溶剂用于沙棘黄酮的提取将是一项非常有意义的工作。离子液体，因其良好的热稳定性、低蒸气压以及对无机、有机物良好的溶解能力，不断被应用于合成化学［10］、药学［11］及材料化学等领域［12］。最近研究发现，离子液体通过加快细胞壁的破坏，对纤维素显示出强的溶解能力，进而促进天然产物活性成分的溶出，在天然产物活性成分提取方面表现出独特的优势［13］。基于对离子液体研究的基础［14-15］及对沙棘研究的兴趣，课题组早期将吡啶类离子液体用于沙棘叶总黄酮提取，发现离子液体可有效提取沙棘叶总黄酮［16］。为进一步探究离子液体种类对沙棘叶总黄酮提取率的影响以及多元复合溶剂的提取性能，8 种季磷离子液体被合成，并将其与含水乙醇组合形成三元复合溶剂，被用于沙棘叶总黄酮的提取。在微波辅助作用下，三元复合溶剂，因其极性可调，表现出优异的提取能力。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与材料

723 型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；XH-200A 微波固液相合成/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；400MHz 核磁共振仪（Bruker公司）。

沙棘叶采自山西省偏关县赵家沟村（野生中华沙棘，采于2017 年6 月），经炒青阴干，粉碎、过40 目筛备用；芦丁标准品（国药集团化学试剂有限公司），三丁基膦（国药集团化学试剂有限公司，质量分数90%），卤代烃（天津市光复精细化工研究所，分析纯）。

1.2 实验方法

1.2.1 季膦离子液体的合成

参照文献［17］，在N2保护及磁力搅拌下，于250 mL 三颈圆底烧瓶中加入50 mL（0.20 mol）三丁基膦，然后用恒压滴液漏斗将0.24 mol 卤代烃滴加到圆底烧瓶，滴加结束后，缓缓升温至微微回流状态。待反应24 h 后，将反应液自然冷却至室温，用30 mL 环己烷洗涤3 次后真空干燥，几乎以定量的产率得到8 种季膦离子液体（正丁基三丁基溴化膦，正辛基三丁基溴化膦，正癸基三丁基溴化膦，十二烷基三丁基溴化膦，十四烷基三丁基溴化膦，溴化-2-羟乙基三丁基膦，氯化-2-羟乙基三丁基膦）（图1），产物经熔点测定及NMR 表征，为目标产物。

图1 季膦离子液体的合成Fig.1 Synthesis of phosphonium ionic liquids

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制

参考文献［18］的方法，准确称量20.0 mg 的芦丁标准品，用无水乙醇将其溶解并定容至100 mL容量瓶，配成0.20 mg·mL-1的芦丁标准溶液。分别移取0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL标准溶液于10 mL比色管中，然后加入0.5 mL 的质量分数5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置5 min，再加入0.5 mL 质量分数10%的硝酸铝溶液，摇匀静置5 min，最后加入3.0 mL 质量分数4%氢氧化钠溶液，用无水乙醇定容至100 mL，静置16 min，在510 nm 处测吸光度。以吸光度值y为纵坐标，芦丁浓度x为横坐标，绘制芦丁标准曲线（图2）。得标准回归方程为

图2 芦丁标准曲线Fig. 2 Standard curve of rutin

y=11.336 9x-0.005 88，R2=0.999 54。

1.2.3 黄酮含量及提取率的测定

参考文献［19］方法，移取0.5 mL 沙棘叶黄酮提取液于10 mL 比色管中，按1.2.2 中方法测定黄酮含量，按照下式计算黄酮提取率：

提取率（%）=C×f×V/m×100%，

式中C：样品中黄酮浓度，mg·mL-1；f：稀释倍数；V：样品体积，mL；m：样品质量，g。

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 离子液体种类的选择

固定微波功率325 W、微波时间6 min、按照料液比1：20（g·mL-1）量取炒青阴干的沙棘叶粉末1.0 g、三元复合溶剂20 mL 用于提取，探究沙棘叶黄酮提取率与离子液体种类的关系。其中三元复合溶剂按照离子液体浓度0.20 mol·L-1，由离子液体加体积分数60%乙醇配制而成。所用离子液体分别是乙基三丁基溴化膦（A）、正丁基三丁基溴化膦（B）、正辛基三丁基溴化膦（C）、正癸基三丁基溴化膦（D）、十二烷基三丁基溴化膦（E）、十四烷基三丁基溴化膦（F）、溴化-2-羟乙基三丁基膦（G）和氯化-2-羟乙基三丁基膦（H）。

1.2.4.2 微波功率的选择

取炒青阴干的沙棘叶粉末1.0 g、按料液比1：20（g·mL-1）取三元复合溶剂20 mL（由离子液体十二烷基三丁基溴化膦与60%乙醇配制的浓度为0.20 mol·L-1的包含离子液体、水及乙醇的三组分体系）、微波时间6 min、微波功率分别设置为195 W、260 W、325 W、390 W、455 W，探究沙棘叶总黄酮提取率与微波功率之间的关系。

1.2.4.3 微波时间的选择

取炒青阴干的沙棘叶粉末1.0 g，按料液比1：20（g·mL-1）取三元复合溶剂20 mL（由离子液体十二烷基三丁基溴化膦与60%乙醇配制的浓度为0.20 mol·L-1的包含离子液体、水及乙醇的三组分体系）、固定微波功率325 W，设置微波时间2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，探究沙棘叶总黄酮提取率与微波时间之间的关系。

1.2.4.4 乙醇浓度的选择

固定微波功率325 W，微波时间6 min，炒青阴干的沙棘叶粉末1.0 g，按料液比1：20（g·mL-1）取三元复合溶剂20 mL（由离子液体十二烷基三丁基溴化膦与不同浓度含水乙醇配制的浓度为0.20 mol·L-1的包含离子液体、水及乙醇的三组分体系），当含水乙醇浓度为20%、40%、60%、80%、100%时，探究沙棘叶总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。

1.2.4.5 料液比的选择

固定微波功率325 W，微波时间6 min，取炒青阴干的沙棘叶粉末1.0 g，依据料液比1：15、1：20、1：25、1：30、1：35（g·mL-1）分别取三元复合溶剂（由离子液体十二烷基三丁基溴化膦与60%乙醇配制的浓度为0.20 mol·L-1的包含离子液体、水及乙醇的三组分体系）15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL 用于沙棘叶总黄酮的提取，探究提取率与料液比之间的关系。

1.2.4.6 离子液体溶液浓度的选择

固定微波功率325 W、微波时间6 min，取炒青阴干的沙棘叶粉末1.0 g，按料液比1：20（g·mL-1）取三元复合溶剂（由离子液体十二烷基三丁基溴化膦与60%乙醇配制的不同浓度的包含离子液体、水及乙醇的三组分体系）20 mL。为了比较季膦离子液体与吡啶离子液体对沙棘总黄酮的提取效果，参照文献［16］设置离子液体浓度为0.2 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.6 mol·L-1、0.8 mol·L-1、1.0 mol·L-1，探究沙棘叶总黄酮提取率和离子液体浓度之间的关系。

1.2.5 响应面法优化沙棘叶总黄酮提取工艺

在Box-Benhnken 试验设计原理的基础上，根据单因素试验结果，以沙棘叶总黄酮提取率（Y）为响应值，利用Design Expert 8.0.6 软件对单因素实测结果进行响应面分析，优化提取工艺。通过最高提取率和最低提取率的差值比较，最终确定以微波时间（A）、乙醇浓度（B）、液料比（C）、离子液体浓度（D）为自变量，以沙棘叶总黄酮含量（Y）为响应值，利用Design Expert 8.0.6 软件设计四因素三水平试验（表1）。

表1 响应面法试验的因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface method experiments

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 离子液体种类对沙棘叶黄酮提取率的影响

将8 种季膦离子液体用于沙棘叶总黄酮的提取，如图3 所示，随着离子液体烷基链的增长，提取率逐渐提高，当离子液体烷基链是12 个碳的十二烷基时，提取率达到最高，烷基链进一步增长提取率下降。相同碳链的离子液体溴化2-羟乙基三丁基膦和乙基三丁基溴化膦相比，提取率只是稍微提高，羟基的氢键作用表现得很微弱。阴离子不同的氯化2-羟乙基三丁基膦作为提取剂时的提取率略高于溴化2-羟乙基三丁基膦，进一步说明离子液体的极性是影响提取率的重要原因，三元复合溶剂的提取效果仍然遵从相似相溶原理。通过不同离子液体提取率的比较，离子液体为十二烷基三丁基溴化膦时，沙棘叶总黄酮提取率最高。

图3 不同离子液体对沙棘叶黄酮提取率的影响Fig. 3 Effect of ionic liquids on the extraction rate of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.2 微波功率对沙棘叶黄酮提取率的影响

微波对生物大分子高级结构的次级键如氢键、范德华力等具有一定的破坏作用。由图4 可知，沙棘叶总黄酮提取率随微波功率的增加先增后减，当微波功率为325 W 时，黄酮提取率达到最高。这可能是因为微波功率过大，促使原料中部分有效成分发生降解或变性，导致溶剂中总黄酮含量降低，进而影响沙棘叶总黄酮的提取［8］，且功率过高时，会增加能耗，增大成本，故最佳微波功率选择325 W。

图4 微波功率对沙棘叶黄酮提取率的影响Fig. 4 Effect of microwave power on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.3 微波时间

由图5 可知，沙棘叶中总黄酮提取率随微波时间的增加而先增大后减小，当微波时间为4 min 时，沙棘叶中总黄酮提取率达到最高，当微波时间为6 min 时，黄酮提取率下降，原因可能是当微波时间过长时，会使部分黄酮化合物发生分解，使沙棘叶总黄酮提取率下降［8］。故最佳微波时间选择4 min。

图5 微波时间对沙棘叶黄酮提取率的影响Fig. 5 Effect of microwave time on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.4 乙醇浓度

选用含水乙醇与离子液体组成的三元复合溶剂作为提取剂提取沙棘叶总黄酮，由图6 可知，随着乙醇浓度的升高，提取率先增加后减小，当乙醇浓度达到80%时，沙棘叶中总黄酮提取率达到最高。这可能是因为三元复合溶剂中乙醇含量低对黄酮类化合物的溶解性比较差，导致沙棘叶总黄酮溶出不完全，提取率低；但当乙醇含量太高时，三元复合溶剂极性改变明显，不利于黄酮的溶出，使黄酮提取率下降。所以选取80%乙醇配制离子液体、水及乙醇组合的三元复合溶剂，提取效果最佳。

图6 乙醇浓度对沙棘叶黄酮提取率的影响Fig. 6 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.5 料液比

由图7 可知，当沙棘叶与三元复合溶剂的料液比为1：30（g·mL-1）时，沙棘叶中总黄酮提取率达到最高，当料液比大于1：30（g·mL-1）后，随着料液比的增加，沙棘叶中总黄酮提取率缓慢减少。其原因可能是料液比为1：30（g·mL-1）时，溶剂中的沙棘叶已得到足够的浸润，再增加溶剂，不仅使微波能量分散，而且杂质溶出增多，导致沙棘叶总黄酮提取率下降［8］。因此，选择1：30（g·mL-1）的料液比为最佳料液比。

图7 料液比对沙棘叶黄酮提取率的影响Fig. 7 Effect of the ratio of solid to liquid on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.6 离子液体浓度的影响

由图8 可知，三元复合溶剂中溴化十二烷三丁基膦浓度逐渐增加时，沙棘叶黄酮提取率先增后降。当离子液体浓度为0.80 mol·L-1时，沙棘叶中黄酮提取率最高。继续增加离子液体浓度，沙棘叶中总黄酮提取率逐渐降低。原因可能为离子液体浓度大时，使得沙棘叶黄酮提取液黏稠度增大，不利于溶质传质，致使沙棘叶中总黄酮提取率下降。因此选择离子液体浓度为0.80 mol·L-1的三元复合溶剂作为提取剂。

图8 离子液体浓度对沙棘叶黄酮提取率的影响Fig. 8 Effect of the ionic liquid concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.2 响应面结果与分析

通过Design Expert 8.0.6 软件对表2 数据进行分析，得到回归方程为Y=8.24－0.19A+0.011B－0.022C + 0.035D + 0.032AB－0.13AC +0.34AD+0.070BC+0.15BD+5.0×10-3CD－0.44A2－0.62B2－0.49C2－0.28D2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

根据相应的试验表进行试验，然后对试验数据进行二次回归拟合，得到包含一次项、二次项、交互项的二次方程，并分析每个因素的交互效应和主效应，最终在一定水平范围内求出最佳值，结果见表3。依据表3 数据，参考文献［20-21］的方法进行分析，可知该回归方程极显著（F=26.68，P＜0.000 1），失拟项不显著（F=0.091 0，P＞0.05），即建立的模型有意义。A、AD、A2、B2、C2、D2均呈极显著影响（P＜0.01），回归系数R2为0.963 9，表明该模型相关度良好；校正决定系数R2adj为0.927 7，表明模型拟合度较为理想，实际测值与预测值能较好的契合，误差小。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.1 响应面的分析与优化

响应面能够直观地显示出因素与因素之间的交互作用。固定微波时间（A）、含水乙醇浓度（B）、料液比（C）、离子液体浓度（D）中一个因素，探究余下三个因素对沙棘叶中总黄酮的交互作用影响，结果如图9－14 所示。

图9 微波时间和乙醇浓度对沙棘叶总黄酮提取率的影响Fig. 9 Effect of microwave time and ethanol concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.2.2 验证试验

根据回归模型，通过Design Expert 8.0.6 软件分析，沙棘叶总黄酮最佳提取条件为微波时间3.5 min、乙醇浓度为80%、料液比为1：30（g·mL-1）、离子液体浓度为0.78 mol·L-1，此条件下预测沙棘叶中总黄酮得率为8.26%。为验证响应面法的准确性，在微波时间3.5 min、乙醇浓度为80%、料液比为1：30（g·mL-1）、离子液体浓度为0.78 mol·L-1的条件下进行3 次验证试验，得平均吸光度为0.456 A，沙棘叶总黄酮的平均得率为8.11%。实验值与预测值相差仅0.15%，说明该响应面法得出的最佳提取工艺适用于沙棘叶总黄酮的提取。

3 结论

本试验探究了微波辅助三元复合溶剂提取沙棘叶总黄酮的工艺条件，研究显示：各因素对沙棘叶总黄酮提取率影响的大小顺序为：微波时间＞离子液体浓度＞料液比＞含水乙醇浓度。通过单因素分析并结合响应面法优化得出沙棘叶总黄酮最佳提取条件为：微波时间3.5 min、离子液体为溴化十二烷三丁基膦且离子液体浓度为0.78mol·L-1、配制三元复合溶剂的含水乙醇浓度为80%、料液比为1：30（g·mL-1）。在该条件下，沙棘叶总黄酮的提取率达到了8.11%，高于传统溶剂乙醇的提取率1.258 2%［22］，也高于吡啶类离子液体的提取率3.65%［16］，通过调控多元复合溶剂各组分比例，有效调节复合溶剂的极性、黏稠度，进一步提升溶剂对纤维素的溶解能力、细胞的破壁能力及传质能力，高效促进生物活性成分的析出。在微波辐射与三元复合溶剂的双重作用下，沙棘叶总黄酮溶出速度快、提取时间短、提取率高，为沙棘叶总黄酮的提取提供了一种比较新颖的方法。

图10 料液比和微波时间对沙棘叶总黄酮提取率的影响Fig. 10 Effect of microwave time and the ratio of solid to liquid on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

图11 微波时间和离子液体浓度对沙棘叶总黄酮提取率的影响Fig. 11 Effect of microwave time and ionic liquid concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

图12 料液比和乙醇浓度对沙棘叶总黄酮提取率的影响Fig. 12 Effect of ethanol concentration and the ratio of solid to liquid on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

图13 离子液体浓度和乙醇浓度对沙棘叶总黄酮提取率的影响Fig. 13 Effect of ionic liquid concentration and ethanol concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

图14 料液比和离子液体浓度对沙棘叶总黄酮提取率的影响Fig. 14 Effect of the ratio of solid to liquid and ionic liquid concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves