栓菌锰过氧化物酶对合成染料的生物脱色研究

聂志强，席镜慧，杨秀清

（山西大学 生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006）

0 引言

纺织印染、造纸、化妆品等行业对合成染料的使用需求连年递增，其中约有10%～20%的染料随废水排放［1］。合成染料种类繁多，包括偶氮染料、噻嗪类染料、三苯甲烷染料、蒽醌染料、二苯乙烯染料等，其中偶氮染料产量最大，约占合成染料的70%［2］。这些染料多含有芳香环结构，较难降解，且具有致癌、致突变等毒性。在国家倡导“生态优先、绿色发展”的政策导向下，染料废水无害处理是环境保护首要解决的重点问题。

国内外处理偶氮染料废水的方法主要有生物法、物理法、化学法等，其中生物法比物理和化学方法更具优势。可降解染料的微生物有细菌和真菌，主要包括生物吸附、酶催化降解等方式。多数真菌的脱色机制一般为生物吸附，但是白腐真菌不同，它主要通过胞外分泌一些酶类来降解染料。这些酶包括锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）、漆酶（laccase，Lac）、木素过氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）等，具有非特异性、无须底物诱导、效率高、反应条件温和［3］等优点。MnP 属于氧化还原酶类，分子内部包含一个血红素辅基，对多种合成染料具有广谱降解能力。近年来研究人员利用白腐菌产锰过氧化物酶对多种合成染料进行脱色取 得 了 一 系 列 成 果。例 如，Zhang 等［4］从Cerrena unicolorBBP6 中提取纯化的MnP 对多种染料（刚果红、甲基橙、溴酚蓝、结晶紫等）具有明显的脱色效果，其中对结晶紫的脱色率可达80.9%，并且在牛仔布漂白方面也有很好的表现。李慧星［5］研究发现黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的MnP 氧化脱色靛蓝6 h 靛蓝脱色率可达90.18%。一种海洋来源的担子菌（Peniophorasp. CBMAI 1063）经过7 d 处理后对纺织染料活性黑的脱色率达94%［6］。有研究利用一种新菌株L-25 分泌的MnP 可高效脱色12 种不同的偶氮和蒽醌类染料，脱色率在84.9%～99.6%之间［7］。平菇（Pleurotus ostreatus）分泌的MnP 在pH 4.0 的条件下，对多 种苯酚磺酞类染料进行脱色，结果表明染料结构对脱色率有显著影响［8］。

前期研究筛选到一株白腐菌栓菌Trametessp.SQ01，其分泌的MnP 对三苯甲烷类染料具有较强的脱色能力［9］。本文旨在通过单因素实验和响应面设计进一步研究并优化白腐菌SQ01 锰过氧化物酶对偶氮染料的脱色条件。在此基础上对天青A 染色的棉织布进行漂白，进一步拓展MnP 在染料废水生物脱色领域的应用。

1 材料

1.1 菌株及产酶条件

栓菌Trametessp. SQ01 由本实验室筛选并保存，采用PDA 培养基［10］培养，菌株产酶体系及产酶培养基参照文献［11］。

1.2 主要试剂和仪器

偶氮染料固蓝RR、橙黄G、氨基黑10B、刚果红以及噻嗪染料天青A 购自生工生物工程股份有限公司，均为分析纯。

Eppendorf 5424 台 式 离 心 机、日 立UV-2010 紫外分光光度计、BS-2F 数码振荡培养箱、pH 计、恒温培养箱。

2 方法

2.1 MnP的分离纯化及酶活测定

经2 次丙酮沉淀和DEAE-52 柱层析法纯化［11］MnP。以每分钟生成1 μmol Mn3+所需的酶量定义为一个酶活单位（U），酶活测定方法参照文献进行［11］。

2.2 染料脱色体系及脱色率

脱色体系包括酒石酸钠缓冲液（pH 4.5 20 mmol/L），MnSO4（1 mmol/L），H2O2（0.1 mmol/L）和不同浓度的染料和MnP，以上均为终浓度。偶氮染料的脱色率通过紫外-可见分光光度计测量脱色前后最大吸收波长吸光度值来计算。

脱色率（ŋ）计算公式为：

其中，A0为脱色反应前溶液的吸光值，At为脱色反应后溶液的吸光值。实验设3 个平行样品，结果表示为平均值±标准偏差。

2.3 实验设计

2.3.1 单因素实验

为研究影响MnP 脱色偶氮染料的因素，分别以温度、pH 值、染料浓度、酶浓度及脱色时间进行单因素实验，各因素水平见表1。

表1 单因素实验水平表Table 1 Level table of single factor experiments

2.3.2 Box-Benhnken实验

根据单因素实验结果选取温度、pH、染料浓度和酶浓度4 个主要因素，每个因素选3 个水平，参照文献［12-14］进行Box-Benhnken 组合实验设计，响应面设计因素水平见表2。

表2 响应面设计因素水平表Table 2 Factors and level value of response surface methodology

2.4 MnP对天青A染色棉织布的漂白应用

棉织布染色前需要先进行漂白以去除棉坯布表面的浆料和杂质，然后洗净、晾干、裁成方块状，使用1 g/L 的天青A 染料进行染色，并不断搅拌以保持染色均匀［15］。将染色好的棉织布置于20 mL脱色体系中，脱色条件除时间外采用响应面优化后的数值，对照除不添加酶外处理方式相同。每隔20 min 记录最大吸收波长475 nm 的OD 值。已测得染料浓度（x，g/L）与OD475（y）之间呈线性关系，即y=3.963 2x+0.079 2。因此通过测定脱色体系中染料浓度的变化来反映漂白效果（ŋ）。

定义计算公式为：ŋ=（ct-c0）/1×100%。即溶液中染料浓度越高，对棉织布漂白效果越好。其中，c0为脱色反应前溶液的染料浓度，ct为脱色反应后溶液中的染料浓度。

实验设3 个平行样品，结果表示为平均值±标准偏差。

2.5 数据统计分析方法

响应面分析使用软件Design Expert 12.0，数据处理分析及制图使用软件Origin 2018。

3 实验结果

3.1 MnP脱色偶氮染料的单因素实验

温度、pH 值、染料浓度、酶浓度、脱色时间因素对偶氮染料生物脱色的影响见图1。

温度对偶氮染料的脱色情况如图1A 所示。在30°C～50°C 范围内，脱色率随着温度的升高逐渐增 大。40 °C ～50 °C 脱 色 最 佳，固 蓝RR 盐、橙 黄G、刚果红、氨基黑10B 脱色率分别为84.1%、46.6%、43.3%、41.5%。

pH 对偶氮染料的脱色情况如图1B 所示。在pH 3～7 范围内，脱色率呈先上升后下降的趋势。pH 4.5 时，脱色效果最佳，固蓝RR 盐、橙黄G、氨基黑10B、刚果红的脱色率分别为82.2%、45.6%、41.5%、42.9%。

染料浓度对偶氮染料的脱色情况如图1C 所示，当染料浓度较低为20 mg/L～100 mg/L 时，脱色率最佳。随着染料浓度的继续增加，脱色率开始降低。当染料浓度大于100 mg/L 时，脱色率呈现不可逆的下降。由此可以得出来源于Trametessp.SQ01 的MnP 最高耐受染料浓度为100 mg/L，且较低的染料浓度更加利于脱色的进行。

酶浓度对偶氮染料的脱色情况如图1D 所示。在MnP 浓度100 U/L～400 U/L 范围内，脱色率随着酶浓度的升高逐渐增加。当酶浓度达到400 U/L时，固蓝RR 盐、橙黄G、氨基黑10B、刚果红的脱色率分别达到79.2%，42.6%，38.5%，40.9%。在400～600 U/L 范围内继续增加酶浓度，脱色率增幅减小，因此认为400 U/L 为MnP 的最适脱色酶浓度。

脱色时间对MnP 的脱色效果的影响见图1E。固蓝RR 盐在2 h～4 h 时脱色率明显增加，4 h 时脱色率达到79.2%，4 h～24 h 脱色率增幅很小，可见4 h 为固蓝RR 盐的最适脱色时间。在2 h～24 h 范围内，随着时间的延长，橙黄G、氨基黑10B、刚果红的脱色率有所增加但是增幅较小，表明这三种染料较难脱色且延长时间对提高脱色率作用不明显。因此选择2 h 作为这三种染料的最适脱色时间。

图1 MnP 脱色偶氮染料单因素实验Fig.1 Single factor experiments of decolorizing azo dyes by MnP

3.2 Box-Benhnken响应面法优化

响应面Box-Benhnken 组合实验设计的29 组实验结果见表3，脱色率均在57.5%以上。对表3 实验数据进行多项拟合，得到脱色率（ω）对温度、pH 值、染料浓度、酶浓度的二次多项回归方程为：ω = 83.12－1.59A+0.40B－3.58C+5.56D－2.38AB+1.95AD+1.23BD－1.45CD－5.61A2－1.99B2－6.99C2－9.58D2对该回归模型进行方差分析，结果见表4 与表5。回归方程模型的P值＜0.000 1，说明回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量与全体自变量之间的线性关系是极显著的，即这种实验方法是可靠的。模型一次项A、C、D 差异极显著，B 差异不显著；交互项AB 差异极显著，AD、CD 差异显著，其他交互项差异不显著；二次项差异均极显著，说明所选因素与响应值之间不是简单的线性关系。本实验测得的信噪比为26.95，在合理范围之内。变异系数为1.84%，低于10%，说明实验的可信度和模型精确度较高。模型的相关系数R2=0.965 8＞0.8，说明该模型能较好地描述实验结果，可以解释约96.58%的实验中脱色率的变化。综合以上分析，本次拟合质量较高且模型的精确度高，可用于分析和预测MnP 脱色偶氮染料固蓝RR 盐的各因素水平的优化。

表3 响应面优化实验结果Table 3 Results of response surface optimization experiment

表4 响应面实验结果的方差分析Table 4 Analysis of variance of the response surface experi‐ment results

表5 二次回归方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of the quadratic model

为了解实验因素对于脱色率的影响情况以及因素两两间对于脱色率的交互影响，本实验选定4个主要因素，优化可以得到每两个因素交互的6 个响应曲面图，选取其中有代表性的3 个，如图2－图4，当其中一个因素的值固定，另一个因素使响应值呈现先上升后下降的趋势，即每个因素都在它的实验水平范围内有最佳值。图2－图4 呈现的曲面拟合度较高，有明显的最高点，表明两因素交互影响大，即酶浓度与温度、酶浓度与pH、酶浓度与染料浓度之间的交互作用显著。各因素对响应值影响程度的排序是：酶浓度＞染料浓度＞温度＞pH。

图2 酶浓度和温度对脱色率的交互作用Fig.2 Interaction of enzyme concentration and temperature on decolorization rate

图3 酶浓度和pH 对脱色率的交互作用Fig.3 Interaction of enzyme concentration and pH value on decolorization rate

图4 酶浓度和染料浓度对脱色率的交互作用Fig.4 Interaction of enzyme concentration and pH value on decolorization rate

通过Design Expert 软件在建立的回归方程和二次曲面模型基础上进行工艺优化得到MnP 脱色染料的最佳条件：温度49.26°C，pH 值为4.64，染料浓度为85.54 mg/L，酶浓度为431.32 U/L，脱色4 h 后脱色率达到84.68%。检验响应面法所得结果的可靠性，同时考虑到实际操作和实验仪器的局限性，修正后的工艺条件为：温度为49 °C，pH 值为4.6，染料浓度为85.5 mg/L，酶浓度为430 U/L。在此条件下进行了3 次重复验证实验，脱色率的平均值为84.5%，与理论值基本吻合，说明实验设计和响应面法优化得到的降解脱色工艺参数准确可靠。

3.3 MnP对天青A染色棉织布的漂白脱色应用

在MnP 生物脱色条件优化的基础上，研究了MnP 对噻嗪染料即天青A 染料染色棉织布的漂白脱色应用，结果见图5。由图5 可知，在0～2 h 范围内，MnP 对染色棉织布的脱色率逐步升高，2 h 脱色率达到16%，2 h～15 h 内脱色率增加不明显。

图5 锰过氧化物酶对天青A 染色棉织布的脱色Fig. 5 Decolorization of azure A dyed cotton fabric by manganese peroxidase

4 分析与讨论

单因素实验表明Tramatessp. SQ01 MnP 在40 °C～50 °C 范 围 内 表 现 出 较 高 的 脱 色 率。这 与Schizophyllumsp. F17 分离得到的MnP 最适脱色温 度 为35 °C［16］存 在 一 定 差 别。表 明Tramatessp.SQ01 MnP 在脱色时相对能耐受较高的温度。酶是一种活性蛋白质，温度对酶促反应有着较大的影响，适当的范围内提高反应温度有利于酶促反应的进行。在pH 值为4.5 时，脱色效果最佳，这与该酶最适pH 为4.5 一致［9］。而与白囊耙齿菌MnP 最适宜pH 值 为6.3 存 在 一 定 的 差 异［17］。Trametessp.SQ01 的MnP 最高耐受染料浓度为100 mg/L，且较低的染料浓度更有利于脱色的。而与其来源于同一菌株的漆酶在染料浓度为100 mg/L 时脱色率最大［10］。可见，虽然这两种酶来源相同，但是它们对于底物浓度的特异性仍存在一定的差异。MnP 的最适脱色酶浓度为400 U/L。据报道Trametessp.SQ01 漆酶脱色RBBR 最适浓度为1 000 U/L［10］，可见这两种木质素过氧化物酶脱色染料的最适酶浓度具有差异性。从Schizophyllumsp. F17 分离的MnP 对偶氮染料刚果红、橙黄G 和橙黄IV 的初始降解率分别为7.74、1.61 和1.38 mg/min。处理1 h后，对橙黄IV（1 mM）进行的最高脱色率达到30%［16］。Trametessp. SQ01 MnP 脱 色 固 蓝RR 盐的最适脱色时间为4 h，橙黄G、氨基黑10B、刚果红的最适脱色时间为2 h。可见不同来源的MnP 均能在较短时间内对偶氮染料明显地脱色。

综上所述，来源于不同菌株的MnP 在最适脱色条件方面不尽相同，来源于同一菌株Trametessp.SQ01 的MnP 与漆酶对于底物浓度的特异性也存在一定的差异。经过单因素、响应面及棉织布脱色实验，可以看出Trametessp. SQ01 MnP 对偶氮染料及噻嗪染料染色的棉织布均有明显的脱色效果。Zhang 等［18］研究发现Cerrena unicolorBBP6 产生的MnP 亦可脱色多种合成染料、降解多环芳烃并且对牛仔布也表现出较好的漂白效果。可见，MnP 在染料废水生物脱色领域具有强大的应用潜力，系统研究脱色条件对其脱色效果的影响，对该酶在工业脱色领域的应用具有一定的参考价值。

5 结论

本文研究了Trametessp. SQ01 MnP 对偶氮染料脱色的能力及其影响因素，通过单因素实以及Box-Benhnken 组合实验得到最优脱色条件，脱色4 h 脱色率为84.5%，对偶氮废水的脱色工艺具有一定的参考价值。在最优脱色条件下，采用MnP 对天青A 染色的棉织布进行漂白应用，经过2 h 脱色率为16%。这表明Trametessp. SQ01 的MnP 在偶氮和噻嗪染料废水生物脱色领域具有潜在的应用价值。