基于发光铜纳米簇的荧光猝灭测定阿霉素

张艳艳，张少阳，张国梅，董川，双少敏

（山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006）

0 引言

癌症是恶性肿瘤的统称［1］，是造成人口死亡的主要因素之一。据最新统计，全球已出现约1 820万癌症病例，专家预言未来将持续上涨。因此癌症的治疗非常重要。阿霉素［2-3］，亦称多柔比星，是一种抗生素类药物，用于抗肿瘤，缓解恶性肿瘤扩散。但服用过量，可使人体产生脱发、恶心、呕吐等现象，严重时有致突变和致癌的可能，也易产生心脏毒性和骨髓抑制作用［4］。发展一种简单、线性范围较宽且快速的方法检测阿霉素是非常关键的。目前使用的方法有：电化学阻抗法［5］、循环伏安法［6］、拉曼光谱学及液相色谱法［7］等，其中荧光分析法有高灵敏度、易操作、低成本及检测速度快等特性而被研究者广泛关注。近年来，用于检测阿霉素的荧光 材料有碳点（CDs）［8］、量子点（QDs）［9］、复合材料［10］和上转化纳米粒子［11］等，但碳点合成所需温度高，量子点毒性高，金属纳米簇作为新型荧光探针具有合成条件温和简单、水溶性好和生物相容性好而被广泛应用于药物的检测，近期已有金属纳米簇被用于检测阿霉素的报道［12］。本文用青霉素钾（PGP）作为稳定剂和还原剂，“一步法”合成了蓝绿色荧光铜纳米簇（PGP＠CuNCs），其中青霉素钾［13］是一种抗菌类药物，内含有β-内酰胺环和噻唑环，不仅对铜有很强的亲核力，而且还具有一定的还原作用，在合成中起到稳定和还原的双重作用。基于一定浓度的阿霉素（Doxorubicin，Dox）能明显降低CuNCs 的荧光强度而建立了定量检测阿霉素的新方法。合成和检测过程示意图如图1 所示。

图1 PGP＠CuNCs 的合成和应用示意图Fig. 1 Schematic illustration of the synthesis and application of PGP＠CuNCs

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

（1）实验药品：青霉素钾、硝酸铜、盐酸阿霉素、氢氧化钠和卡托普利等均为分析纯。

（2）实验设备：紫外可见分光光度计（UV-2910，岛津公司），荧光光谱仪（F-4500，日立公司），红外光谱（Bruker，布鲁克科技有限公司），X 射线电子能谱仪XPS（Kratos Axis Ulradld，岛津公司），透射电子显微镜TEM（JEM-2100，JEOL 有限公司）。

1.2 PGP＠CuNCs的合成

青霉素钾（PGP）包裹的铜纳米簇的合成过程如下：先将3 mL，10 mmol/L 的青霉素钾溶液超声5 min，加入1 mL，10 mmol/L 硝酸铜溶液，搅拌10 min，再加入NaOH（1 mol/L）调整pH 值大约为11。然后将混合溶液置于45 ℃的水浴中持续搅拌4 h，将获得的溶液静置冷却，离心，得到浅蓝色的PGP＠CuNCs 溶 液。最 后 将 其 存 于4 ºC 冰 箱 中备用。

1.3 PGP＠CuNCs线性及选择性测定

将100 μL CuNCs 溶 液、600 μL PBS 缓 冲 溶 液（pH=7.4）和300 μL 二次水的混合液加入比色皿中，设激发波长为385 nm，扫描，并记录数据。随后向探针中滴加不同浓度的阿霉素溶液，室温下充分反应3 min，再扫描并记录。

此外，同上述条件下，此探针体系中分别加入10 μmol/L 的阿霉素（doxorubicin）和其他物质，包括有：庆大霉素（Gentamicin）、葡萄糖（Glucose）、林可霉素（Lincomycin）、青霉素（Penicillin G）、环丙沙星（Ciprofloxacin）、红 霉 素（Erythromycin）、氯 霉 素（Chloramphenicol）、土霉素（Oxytetracycline）、半胱氨酸（Cysteine）、谷胱甘肽（Glutathione）、卡托普利（Captopril）、高半胱氨酸（Homocysteine）、盐酸硫胺（Thiamine）和尿素（Urea），扫描且记录其荧光变化。选择这些物质，是因为庆大霉素、红霉素、氯霉素、土霉素等干扰物的结构与阿霉素相近，也含有酰胺基和羟基，但相对位置有差异，导致选择性不同，这些实验药品都由阿拉丁网购买所得。

1.4 细胞毒性和成像实验

毒性监测步骤如下：将人体肝癌细胞SMMC7721 放到96 微孔板培养皿中37 ℃下培养一段时间后，向其中加不同浓度的CuNCs 继续孵育24 h。然后吸出培养基，再向每个孔中加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL，DMEM 作溶剂），再孵育4 h，吸出MTT 液，向每个孔中加入150 μL DMSO，振荡10 min。激发360 nm 处，酶标仪测其吸光度，并计算其存活率。

将肝癌细胞SMMC7721 放于含牛胎儿血清和盘尼西林-链霉素的培养基中培养24 h。向培养基中分别加入CuNCs 和CuNCs-Dox，孵育1 h，吸出培 养 液，pH=7.4 的PBS 缓 冲 溶 液 洗3 次，再 加 入1 mL PBS 缓冲溶液。最后，在激发405 nm 下观察显微镜内成像情况。

2 结果与讨论

2.1 PGP＠CuNCs的合成及表征

本文采取荧光、紫外及XPS 和TEM 对制备的PGP＠CuNCs 性 能 进 行 了 分 析。 图2 所 示 为CuNCs 的TEM 图 像，从 图2（A）中 可 观 察 到：CuNCs 外观似球形，分散性好；插图表示其粒径大约在2.5 nm 左右，图2（B）为CuNCs 的高倍电镜图，可看出明显的干涉条纹，测得晶面间距为0.210 nm，接近铜（111）的晶面间距0.202 nm，可归为铜纳米的（111）晶面［14］。

图2 （A）PGP＠CuNCs 的TEM 图像；（B）PGP＠CuNCs 的高倍电镜图Fig. 2 （A）TEM images of the PGP＠CuNCs；（B）The HRTEM image of PGP＠CuNCs

图3（A）为不同激发下PGP＠CuNCs 的荧光图，随着激发波长增大，CuNCs 荧光强度先增加后降低，发射峰位置不变。图3（B）为CuNCs 的荧光光谱和紫外光谱。激发波长为385 nm 时，CuNCs在474 nm 处有荧光发射峰，插图（a）（b）分别为可见光 下 和 紫 外 灯 下 的 照 片。 图3（C）为PGP 和PGP＠CuNCs 的紫外吸收光谱，PGP 在241 nm 和321 nm 处有吸收峰，而CuNCs 只在270 nm 处有弱吸收峰，证实了CuNCs 的合成且NCs 无大颗粒。图3（D）为CuNCs 的CIE 色度图，图中黑色点所示颜色与NCs 紫外下一样，为青色光。以硫酸奎宁（λem=370 nm，量子产率为0.542 6）作为参比，算得CuNCs 的量子产率为1.36%。

图3 （A）PGP＠CuNCs 在不同激发下的荧光光谱；（B）CuNCs 的紫外和荧光谱图，内插图：在日光下和紫外灯的照片；（C）纯PGP 与CuNCs 的紫外光谱；（D）CuNCs 的CIE 色度图Fig. 3 （A）The fluorescence spectra of the PGP＠CuNCs at different excitation wavelengths；（B）The UV-vis absorption and fluorescence spectra of CuNCs；（C）The absorption spectrum of PGP and CuNCs；（D）The CIE chromaticity photo of CuNCs

图4（A）所示为纯的PGP与PGP＠CuNCs 的红外光谱图，用于对CuNCs 表面结构进行分析。图中CuNCs 和PGP 在3 300 cm-1～3 500 cm-1、1 630 cm-1～1 690 cm-1及1 050 cm-1～1 000 cm-1附近都有吸收峰，分别为羟基（O－H）/氨基（N－H）的伸缩振动、酰胺I 带（羰基（C=O）伸缩振动）及Ar－O中C－OC 基团的伸缩振动峰，说明CuNCs 表面仍含有酰胺基团。此外，PGP 在1 776 cm-1处强吸收峰为C=O伸缩振动，在1 600 cm-1～1 450 cm-1处的吸收峰为苯环骨架中C=C 的伸缩振动，1 396c m-1处的吸收峰是酰胺Ⅱ带，而CuNCs 只在1 446 cm-1处有的吸收峰，表明PGP 的官能团可能与铜原子发生了作用。其次在CuNCs 的谱图中还观察到，在2 100 cm-1～2 550 cm-1处有新的振动峰出现，而PGP谱图中在此范围没有峰，可能是因为PGP 表面结构发生降解使其β-内酰胺环开环形成青霉胺，与Cu（Ⅰ）作用形成PGP-Cu（Ⅰ）螯合物，而硫元素与铜离子键合形成Cu－S 键，从而产生新的振动峰，进一步证实了PGP＠CuNCs 的合成。

图4（B）所示为PGP＠CuNCs 的XPS 全谱图，图中含有Cu、S、N、O 和C 等元素。图4（C）为铜（2p）谱。图中显示在932.1 eV 和952.5 eV 处各呈现出一个峰，分别代表为Cu（2p）谱中Cu 2p3/2和Cu 2p1/2的结合能，表明NCs 中含有Cu（I）和Cu（0），Cu（I）可与其形成复合物起稳定作用，而在942.2 eV处只有微弱的特征峰不明显，说明有极少量未作用的二价铜，这个结果与以前的报道一致［15］。图4（D）所示为硫（2p）谱，图中显示分别在S 2p1/2163.9 eV和S 2p3/2161.9 eV 出现吸收峰［16］，推断出铜与硫进行键合，这个结果与红外光谱图相符。

图4 （A）PGP 和PGP＠CuNCs 的红外光谱图；（B）CuNCs 的XPS 全谱图；（C）Cu2p 的谱图；（D）S2p 的谱图Fig. 4 （A）The infrared（IR）spectra of PGP and PGP＠CuNCs；（B）Survey XPS spectrum of CuNCs；（C）The Cu 2p XPS spectrum of CuNCs；（D）The S 2p XPS spectrum of CuNCs

2.2 PGP＠CuNCs对Dox的线性和选择性实验

图5（A）所展示的是滴加不同浓度的阿霉素后，CuNCs 探针强度猝灭的程度。由图看出，当阿霉素的浓度从0 滴加到100 μmol/L 后，CuNCs 的荧光峰几乎消失，在601 nm 处出现等发射点，在650 nm 处的有微弱的荧光峰，新的荧光峰表明新物质的生成。图5（B）和（C）为荧光强度的相对比值（F0/F）与阿霉素（Dox）浓度的线性关系图，浓度在1 μmol/L～35 μmol/L 范围内，线性方程为F0/F=1.019 19C（μmol/L）+0.162 4，C为Dox的浓度，R2=0.997 8；在45 μmol/L～100 μmol/L 范 围 内，方 程 为F0/F=-1.301 94+0.057 57C（μmol/L），R2=0.991 3。经LOD=3σ/k公式计算，检出限为18 nmol/L。下表1 所示是此项工作中PGP＠CuNCs 与其他测定阿霉素的荧光纳米材料的对比结果。从表中看出，PGP＠CuNCs 探针对阿霉素的检测线性范围宽，灵敏度较高。为了探索CuNCs对阿霉素（Dox）的专一性识别，考察了一些干扰物对CuNCs 荧光强度的响应程度。如图5（D）所示，除了阿霉素可以明显地猝灭PGP＠CuNCs 的荧光外，其他干扰物没有影响。因此，CuNCs 对Dox有高的选择性。

图5 （A）不同浓度的阿霉素对PGP＠CuNCs 的荧光强度影响；（B）-（C）阿霉素与CuNCs 荧光强度的线性关系；（D）PGP＠CuNCs 对其他物质的选择性Fig. 5 （A）Fluorescence spectra of CuNCs in different concentrations of doxorubicin；（B）-（C）The relationship between the fluorescence intensity CuNCs and the concentrations of doxorubicin.（D）The fluorescence response of CuNCs in the presence of different substances

表1 不同荧光探针或其他荧光纳米材料对阿霉素检出限灵敏度的对比Table 1 Comparison between the PGP＠CuNCs and different fluorescent probe or other fluorescent nanomaterials for the determination of doxorubicin

2.3 Dox诱导PGP＠CuNCs猝灭机理

为进一步探索荧光猝灭机理，分别研究了阿霉素存在下探针的TEM 和荧光寿命。图6（A）和（B）表明，加入Dox 后，CuNCs 形状未变，但粒径变小，由原来的2.5 nm 变为0.8 nm 左右。据此推测，加入阿霉素使得CuNCs 刻蚀，这可能是PGP 配体表面的酰胺基发生了质子化和去质子化的结果，导致了PGP＠CuNCs 的刻蚀，因此刻蚀的CuNCs 光学特性消失。图6（C）为CuNCs 和CuNCs-Dox 体系的荧光寿命分析，CuNCs 的平均寿命为4.01 ns，加入一定浓度的Dox，平均寿命降低到3.70 ns，几乎没有改变，说明属于静态猝灭［12，19］。

图6 （A）-（B）阿霉素存在下CuNCs 的TEM 图和粒径图；（C）CuNCs 和CuNCs-Dox 体系的荧光寿命图Fig.6 （A）-（B）TEM images and particle size of the PGP＠CuNCs in the presence of doxorubicin；（C）Fluorescence decay lifetime of PGP＠CuNCs and PGP＠CuNCs in the presence of doxorubicin

2.4 实际样品检测

研究PGP＠CuNCs 探针检测实际样中的阿霉素来验证方法的可行性。收集样品来自山西省人民医院的比柔多星注射液。结果如表2 所示，计算得出相对误差在－0.21～3.90 之间，相对较小，表明CuNCs 可用于实际样品阿霉素的含量测定。

表2 检测实际样品中的阿霉素的含量Table 2 Determination of doxorubicin in samples

2.5 PGP＠CuNCs的细胞成像

图7 所示为PGP＠CuNCs 的细胞毒性研究，从图中可看出：不同浓度的CuNCs 处理过的SMMC7721 细胞培养24 h 后，随着NCs 浓度的增大，存活率呈现微弱下降，当CuNCs 浓度为0.6 mg/mL 时，存活率依保持在85%以上，说明CuNCs毒性很低。

图7 PGP＠CuNCs 对SMMC772 细胞的毒性Fig. 7 Cell viability of PGP＠CuNCs at different concentrations（mg/mL）

图8 所示为激光共聚焦扫描显微荧光成像图。图8（A－C）为含0.6 mg/mL CuNCs 溶液的人体肝癌SMMC7721 细胞的共聚焦图像：（A）明场；（B）暗场；（C）明 场 与 暗 场 叠 加 图。 图8（D-F）为PGP＠CuNCs 溶液加入阿霉素后的共聚焦图像：（D）明场；（E）暗场；（F）明场与暗场叠加图。图中看出SMMC7721 细胞状态良好，呈蓝色荧光，说明CuNCs 可进入细胞质中。对比得出：加入Dox 后标记的SMMC7721 细胞的荧光强度减弱，说明CuNCs 有好的生物相容性，可以将PGP＠CuNCs 传感体系应用于生物荧光成像。

图8 （A）-（C）PGP＠CuNCs 在人肝癌SMMC7721 细胞中的荧光共聚焦成像；（D）-（F）加入阿霉素后的图片，注：A 与D 明场；B 与E 暗场；C 与F 明场和暗场的叠加图Fig. 8 Confocal bright field（A and D），fluorescence（B and E），and overlap images（C and F）of SMMC7721 cells incubated with PGP＠CuNCs（A-C）and presence of doxorubicin（D-F）

3 结论

以青霉素钾（PGP）为配体和还原剂一步合成铜纳米簇。实验结果表明：该探针的荧光能被阿霉素 猝 灭，在1.0～35.0 μmol/L 和45.0～100.0 μmol/L 范围内有两段好的线性，且检出限低，从而建立了检测阿霉素的方法。这种荧光测定方法应用于实际样中对阿霉素的检测。此外，本实验还在人体肝癌SMMC7721 细胞内实现了荧光共聚焦成像。