Sparc对瘢痕疙瘩成纤维细胞以及正常人皮肤成纤维细胞增殖凋亡及Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌影响的研究

朱晓璇，李心怡，王佳妮 ，丁以春，李小静*

病理性瘢痕是由于皮肤创伤过度愈合导致的，分为增生性瘢痕及瘢痕疙瘩，瘢痕疙瘩形成的原因主要是成纤维细胞的过度增生，以胶原蛋白为主的细胞外基质的过度沉积。Sparc蛋白是细胞基质相互作用的重要媒介物。现有实验证明Sparc在肺、真皮、肠、眼睛等纤维化病变组织中呈现高表达。课题组前期研究已初步证明了Sparc与病理性瘢痕形成的相关性，其在病理性瘢痕中存在高表达，可促进正常皮肤以及病理性瘢痕成纤维细胞的增殖，并且能促进增生性瘢痕中Ⅰ型胶原的表达。但其对正常皮肤以及瘢痕疙瘩Ⅲ型胶原的影响尚不明确。该研究通过探讨Sparc蛋白对瘢痕疙瘩纤维化的影响，为研究其作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜切取的人体瘢痕疙瘩组织以及植皮手术中正常皮肤组织，均来自于安徽医科大学第一附属医院门诊及病房自愿行瘢痕疙瘩切取手术以及植皮手术的患者，其中瘢痕疙瘩患者局部无感染溃疡，没接受过任何药物及放射治疗。所有标本取材均已获得患者本人或监护人的知情同意。实验对所有样本的处理方法符合国家卫生和计划生育委员会印发的《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》。

1.2 试剂

CCK-8细胞增殖检测试剂盒(美国Sigma)，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(上海生工科技)，重组人Sparc蛋白(美国Biorbyt公司)，人Ⅰ型胶原抗体、人Ⅲ型胶原抗体(北京康为世纪)。

1.3 方法

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3

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人瘢痕疙瘩成纤维细胞(human keloid fibroblasts, HKF)的分离培养 于超净工作台无菌条件下手术切取新鲜瘢痕疙瘩组织，去除髓核、表皮以及血管等结缔组织，将其切割成约2～3 mm大小置于培养皿中，用PBS清洗2次后以1～2块组织/cm的密度排列整齐，每颗组织块表面滴加1～2滴胎牛血清浸润，置于37°C、5%CO培养箱中培养6～8 h后组织块贴壁，加入适量含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养过夜，第二日观察培养基无污染后换液，之后每2～3 d换液1次，1周后观察有成纤维细胞组织迁移出来，待贴壁生长达80%以上时即可传代。

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2

正常人成纤维细胞(normal fibroblasts, NFs)的分离培养 与超净工作台无菌条件下处理手术切取新鲜皮肤组织，去除表层皮肤等结缔组织，实验方法同1.3.1。

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3

加入Sparc蛋白处理HKF以及NFs 取3～5代呈对数生长期的细胞，待细胞生长至贴壁达80%～90%时胰酶消化，用含15%体积分数胎牛血清的DMEM调整细胞浓度至2×10个/ml接种于96孔板中，每孔100 μl，待细胞贴壁后加入Sparc蛋白培养72 h，将细胞分为实验组与对照组，实验组加2 μg/ml的重组人Sparc蛋白，对照组加入等量培养基，每组设4个复孔。

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3

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4

CCK-8检测细胞增殖 将细胞以3×10个/孔的密度均匀铺至96 孔板中，每组共设8个孔。放入 37℃、5% CO细胞培养箱正常培养12 h至细胞贴壁，形态正常。排枪吸去培养基中旧液，用PBS 缓冲液冲洗2次，对照组加入正常培养基, 实验组加入含Sparc蛋白2 μg/ml的培养基。孵育72 h 后，用排枪吸出各组培养液后，加入按10 %浓度配制的CCK-8溶液混合液，每孔加入混合液100 μl，37℃孵育30 min。调节分光光度计，于450 nm 波长处，检测吸光度(optical density, OD)值。

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5

Annexin V

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FITC/PI双染细胞实验 将细胞培养基转移至15 ml离心管中，用2 ml PBS轻轻润洗细胞，弃去PBS。加入胰酶消化细胞后，用预冷的PBS洗涤细胞2次，弃去PBS。用400 μl的Annexin V结合液悬浮细胞，密度约为1×10个细胞/ml。在细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液混匀，4℃避光孵育15 min。加入10 μl PI染色液混匀，4℃避光孵育10 min。立即使用流式细胞仪检测凋亡率。

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3

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6

Western blot实验检测各组细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达 分别收集HKF以及NFs的实验组与对照组细胞，提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量。制备好的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至聚氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉37 ℃封闭1.5 h后，加入1 ∶2 000稀释的Ⅰ型胶原蛋白抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入1 ∶3 000稀释的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜后与化学发光底物孵育5 min，曝光、显影、定影。用GAPDH作内参验证蛋白含量。同样方法检测Ⅲ型胶原蛋白的表达。

1

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3

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7

RT-PCR检测各组细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达 分别收集HKF以及NFs的实验组与对照组细胞，提取其总RNA，逆转录得cDNA，采用SYBR Green法进行RT-PCR。引物根据GenBank中Ⅰ型胶原蛋白基因序列设计：上游引物：5′TACAGCGTCACTGTCGATGGC 3′ ，下游引物：3′TCAATCACTGTCTTGCCCCAG 5′；Ⅲ型胶原蛋白基因序列设计：上游引物：5′AATTTGGTGTGGACGTTGGC 3′，下游引物：3′TTGTCGGTCACTTGCACTGG 5′；内参GAPDH基因序列：上游引物：5′CAACAGCGACACCCACTCCT 3′，下游引物：3′CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA 5′，由上海生工公司合成。反应参数设置为94℃、30 s预变性，94℃、5 s变性，61℃、35 s退火，42℃、45 s延伸，共40个循环。反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，以Gel pro凝胶吸光度分析软件分析，测其OD值，计算Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达量。将数据导入Graph Prism 8.0.1软件采用单因素方差分析获得柱状图。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行分析，样本间差异比较均采用配对样本

t

检验，

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组细胞增殖比较

CCK-8实验显示加入Sparc蛋白后，实验组HKF(

t

=4.371、

P

=0.007)以及NFs(

t

=2.685、

P

=0.044)增殖状态较对照组增高，差异有统计学意义。各实验组之间差别不显著(

t

=2.052、

P

=0.96),差异无统计学意义(图1)。

图1 CCK-8检测细胞增殖结果

2.2 4组细胞凋亡率比较

流式细胞仪结果表明加入Sparc蛋白后，HKF实验组(

t

=17.591、

P

=0.00)与NFs实验组(

t

=15.679、

P

=0.00)较对照组细胞凋亡率降低(图2)，差异有统计学意义。

2.3 Western blot以及RT-PCR检测各组细胞中Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原表达差异

Western blot实验结果显示，与对照组比较，各实验组Ⅰ型胶原的表达增高，HKF实验组Ⅲ型胶原的表达增高，而NFs实验组增高不明显(图3)；RT-PCR实验结果显示，加入Sparc蛋白后，与对照组比较，实验组HKF(

t

=5.151、

P

=0.014)以及NFs(

t

=18.502、

P

=0.00)的Ⅰ型胶原表达增高，差异有统计学意义；实验组HKF(

t

=3.597、

P

=0.037)以及NFs(

t

=11.295、

P

=0.00)的Ⅲ型胶原的表达增高，差异有统计学意义。而各实验组之间差别不明显(图4)。

图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

图3 RT-PCR检测各组细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达结果

图4 Western blot检测各组细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达结果

3 讨论

瘢痕疙瘩是由于皮肤创伤或自发形成的病理性瘢痕组织，伴随着成纤维细胞的过度增殖以及细胞外胶原的过度沉积。组织损伤可以通过皮下组织重建或瘢痕的形成来愈合，在皮肤愈合的过程中，成纤维细胞负责将创面边缘拉紧，并形成创面瘢痕的细胞外基质。这种病理性的改变伴随着明显的增长特征：其范围超过原先的损伤范围并且持续向周围正常皮肤组织延伸，类似肿瘤，因此也称为良性真皮肿瘤。此外，大量研究表明瘢痕疙瘩与多种细胞因子、基因调节、伤口张力、免疫失调以及细胞外基质生成与调节的失衡有关。因此抑制成纤维细胞的增殖以及胶原蛋白的沉积或许是改善瘢痕疙瘩的有效方式，而找到促进成纤维细胞增殖以及胶原蛋白生成的因素至关重要。Sparc蛋白是一种多功能小分子糖蛋白，在体内分布广泛，可促进损伤后发生的组织重建。最初于1981年被Termine et al作为非胶原成分描述和纯化。Sparc可通过调节血管生成、抑制细胞黏附、促进细胞增殖来促进肿瘤组织的生长及侵袭和转移。目前已有研究证明通过基因沉默的方式靶向抑制成纤维细胞中Sparc蛋白的表达可以抑制硬皮病成纤维细胞的增殖，抑制其Ⅰ型胶原以及Ⅲ型胶原的表达。有研究人员通过Sparc siRNA抑制皮肤成纤维细胞形成和小鼠Sparc基因表达，提出了抑制Sparc表达是抑制纤维化疾病发生的有效途径。并且既往研究也已初步证实了Sparc蛋白与病理性瘢痕的相关性。因此Sparc蛋白或许可以成为治疗病理性瘢痕的新靶点，为病理性瘢痕的治疗提供新的思路。本次实验应用不同实验方法证实了Sparc蛋白对HKF以及正常皮肤成纤维细胞增殖的促进作用，并且对各实验组细胞的凋亡起抑制作用。Sparc实验中Sparc蛋白对于各实验组细胞Ⅰ型与Ⅲ型胶原表达均有促进作用，而Western blot实验中Sparc蛋白对各实验组细胞Ⅰ型胶原表达有促进作用，对于HKF实验组Ⅲ型胶原表达也有促进作用，但是对于NFs实验组Ⅲ型胶原表达的促进作用不明显。以上实验结果提示Sparc蛋白可以促进HKF以及NFs增殖，抑制其凋亡，并且可以促进HKF以及NFsⅠ型与Ⅲ型胶原的表达。但是Sparc蛋白具体是通过哪种途径对瘢痕产生促进作用以及敲除此种基因对瘢痕疙瘩形成的影响还有待进一步研究。