高良姜素对于肺腺癌细胞增殖、迁移能力的影响

汪 新，束 军，代丽丽，沈继龙

肿瘤的十大特征已经成为一种共识，其中包括肿瘤细胞异常的能量代谢以及肿瘤的浸润和转移。肿瘤细胞即使在有氧环境中也无法进行有氧氧化，而只能依赖于糖酵解产生少量能量，这一现象称为瓦博格效应，即有氧糖酵解。肿瘤的转移通常发生在晚期阶段，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞失去极性向间质转化的过程，对于肿瘤转移起着重要作用。高良姜素(galangin, Ga) 具有一定的抗癌作用，如Ga通过抑制糖酵解来抑制肝癌细胞的增殖等过程，或通过抑制EMT过程进而抑制肾癌细胞、胶质瘤细胞的进展。目前Ga对于肺癌治疗的研究罕见，其相关机制尚无明确定论。该文旨在初步探讨Ga对于肺腺癌A549、PC9细胞增殖、迁移能力的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肺腺癌A549、PC9细胞由安徽医科大学基础医学院惠赠；Ga(DG0020)购于成都德思特生物技术有限公司，规格：20 mg/支；RPMI-1640培养基购于美国HyClone公司；胎牛血清购于杭州四季青生物技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司；CCK-8试剂盒(C0038)、青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(100X)、胰酶、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(P0010S)购于上海碧云天生物技术有限公司；乳酸(lactic acid，LD)检测试剂盒(A019-2-1)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒(A020-1-2)、ATP检测试剂盒(A095-1-1)购于南京建成生物工程研究所；人E-钙黏蛋白(E-cadherin, E-cad)ELISA试剂盒(JYM0034Hu)、人N-钙黏蛋白(N-cadherin, N-cad)ELISA 试剂盒(JYM0185Hu)购于武汉基因美生物科技有限公司；酶标仪购于美国Biotek公司。

1.2 实验方法

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细胞培养 肺腺癌A549、PC9细胞分别置于37 ℃、含有5% CO的细胞培养箱中，用含有10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI-1640培养基进行培养。肺腺癌细胞呈贴壁方式生长，视细胞生长状态进行换液、传代。取处于对数生长期的健康细胞进行实验。

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药物配制 用DMSO作为溶剂，将Ga溶于其中并配制成药物溶液，于-20 ℃冰箱保存备用。实验中各组DMSO溶剂浓度不超过0.1%。

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CCK-8法检测不同浓度Ga对于肺腺癌细胞增殖能力的影响 取处于对数生长期的健康肺腺癌A549、PC9细胞，调整好细胞浓度进行96孔板铺板，每孔加入100 μl细胞悬液。细胞贴壁后0药对照组加入100 μl培养基，实验组加入同体积不同浓度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)溶液，各组均设置5个重复孔。培养24、48 h后分别加入10 μl CCK-8试剂，调节酶标仪波长为450 nm进行吸光度(optical density，OD)检测。计算各组细胞活力，细胞活力=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(0药对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。DMSO组细胞活力计算方式与实验组类似，实验重复3次。

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细胞划痕实验检测不同浓度Ga对于肺腺癌细胞迁移能力的影响 在6孔板背面沿直尺划线，每孔3条线。取处于对数生长期的健康肺腺癌A549、PC9细胞，调整好细胞密度，将细胞均匀铺板。在细胞长满后，用枪头垂直于横线划痕，用PBS清洗并在显微镜下拍照即为0 h划痕宽度。实验组分别加入含有不同浓度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)的无血清培养基，对照组加入等量无血清培养基，培养24 h后用PBS清洗并在同一位置拍照，即为24 h划痕宽度。用ImageJ软件分析细胞迁移距离，细胞迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/ 0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

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LD试剂盒检测Ga对于肺腺癌细胞上清液中LD生成量的影响 取处于对数生长期的健康肺腺癌A549、PC9细胞，调整为合适细胞密度，进行6孔板铺板。等细胞生长至70%左右，去除原培养基并清洗，实验组加入2 ml不同浓度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)的培养基，对照组加入同体积培养基。24 h后吸取细胞培养液，离心、收集并用于后续上清液成分检测。按照LD测定试剂盒说明书要求分别对空白组、标准组、待测组(0药对照组及实验组)加样，调节酶标仪波长至530 nm检测OD值，即可计算LD生成量，细胞上清液LD生成量=(待测组OD值-空白组OD值)/(标准组OD值-空白组OD值)×标准品浓度(3 mmol/L)×样本测定前稀释倍数。实验重复3次。

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LDH试剂盒检测Ga对于肺腺癌细胞内LDH活性的影响 按照实验方法1.2.5进行细胞铺板，24 h后用PBS清洗，加入细胞裂解液，刮取细胞并置于4 ℃冰箱裂解30 min后离心，收取上清液用于后续细胞内成分检测。根据BCA蛋白检测试剂盒说明书加蛋白标准品及待测细胞内成分，调节酶标仪波长至562 nm检测OD值，检测待测组(0药对照组及实验组)细胞BCA蛋白表达水平以备后用。按照LDH测定试剂盒说明书要求对标准组、空白组、待测组(0药对照组及实验组)、对照组加样，调节酶标仪波长至440 nm检测OD值，即可计算LDH活性，LDH活性=(待测组OD值-对照组OD值)/(标准组OD值-空白组OD值) ×标准品浓度(2 mmol/L)×样本测定前稀释倍数/待测样本蛋白浓度。实验重复3次。

1

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ATP测定试剂盒检测不同浓度Ga对于肺腺癌细胞内ATP生成量的影响 参照实验方法1.2.6提取肺腺癌细胞内成分，计算待测组(0药对照组及实验组)细胞BCA蛋白表达水平以备后用。按照ATP含量测定试剂盒说明书要求对空白组、标准组、待测组、对照组加样，调节酶标仪波长至636 nm检测OD值，即可计算ATP生成量，ATP生成量=(待测组OD值-对照组OD值)/(标准组OD值-空白组OD值)×标准品浓度(10μmol/L)×样本测定前稀释倍数/待测样本蛋白浓度。实验重复3次。

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人E

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cad与N

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cad ELISA试剂盒检测细胞上清液中E

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cad与N

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cad蛋白量 参照实验方法1.2.5收集肺腺癌细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书要求对空白组、标准组、待测组(0药对照组及实验组)进行加样，调节酶标仪波长为450 nm测定各孔OD值，用空白孔调零。以标准品浓度为横轴、OD值为纵轴，绘制标准曲线计算出待测样品浓度，再乘以稀释倍数即为E-cad、N-cad蛋白表达量。实验重复3次。

2 结果

2.1 Ga抑制肺腺癌A549、PC9细胞的增殖

与0药对照组相比，实验组用不同浓度的Ga分别处理A549、PC9细胞24、48 h后，细胞出现不同程度的增殖抑制现象，而DMSO溶剂对照组对细胞活力的组间差异无统计学意义。24 h(A549：

F

=14.60；PC9：

F

=21.06)检测结果显示，与0药对照组相比，实验组中低浓度Ga(12.5、25 μmol/L)对于A549、PC9细胞的细胞活力影响差异无统计学意义，而较高浓度组Ga(50、100 μmol/L)抑制两种细胞的细胞活力，组间差异有统计学意义(

P

<0.05)。48 h(A549：

F

=127.49；PC9：

F

=85.75)结果表明，实验组Ga对于两种细胞的增殖抑制作用差异均有统计学意义(

P

<0.05)。此外，在高浓度组Ga中，Ga处理细胞时间越长，细胞增殖抑制作用越强(

P

<0.05)。综上，Ga对于肺腺癌A549、PC9细胞的增殖有抑制作用(图1)。

2.2 Ga抑制肺腺癌A549、PC9细胞的迁移

与0药对照组相比，实验组用不同浓度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)作用于肺腺癌细胞24 h(A549：

F

=141.87；PC9：

F

=223.94)，细胞出现不同程度的迁移抑制现象，细胞迁移率的组间差异有统计学意义

P

<0.05(图2)。

2.3 Ga抑制肺腺癌A549、PC9细胞LD生成、LDH活性及ATP生成

与0药对照组相比，实验组用不同浓度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)作用于肺腺癌A549、PC9细胞24 h，LD生成量均逐渐降低，组间差异均有统计学意义(A549：

F

=320.12，

P

<0.05；PC9：

F

=327.61，

P

<0.05)；LDH活性逐渐越低，组间差异均有统计学意义(A549：

F

=153.53，

P

<0.05；PC9：

F

=193.69，

P

<0.05)；ATP生成量出现不同程度降低，除低浓度组Ga(12.5 μmol/L)对于A549细胞组间差异无统计学意义外，其余组间差异均有统计学意义(A549：

F

=87.13，

P

<0.05；PC9：

F

=58.04，

P

<0.05)(表1、2)。

图1 Ga对于肺腺癌A549、PC9细胞增殖能力的影响

表1 不同浓度Ga对于肺腺癌A549细胞LD生成量、LDH活性、ATP生成量及E-cad、N-cad蛋白表达量的影响

表2 不同浓度Ga对于肺腺癌PC9细胞LD生成量、LDH活性、ATP生成量及E-cad、N-cad蛋白表达量的影响

图2 Ga对于肺腺癌A549、PC9细胞迁移能力的影响 ×100

2.4 Ga促进肺腺癌A549、PC9细胞E-cad生成、抑制N-cad生成

与0药对照组相比，实验组用不同浓度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)作用于肺腺癌A549、PC9细胞24 h，上清液E-cad蛋白表达量逐渐增高，组间差异均有统计学意义(A549：

F

=195.38，

P

<0.05；PC9：

F

=160.24，

P

<0.05)；而N-cad蛋白表达量逐渐降低，组间差异均有统计学意义(A549：

F

=260.44，

P

<0.05；PC9：

F

=258.79，

P

<0.05)(表1、2)。

3 讨论

肺癌是全球发病率、死亡率居高位的癌症，目前尚无特效治疗。对于肺癌的治疗方式主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等，但均存在一定的弊端。为了更好地治疗肺癌，提高肺癌患者的生存率，国内外研究者开始研究一些具有抗癌活性的纯天然化合物，Ga就是其中一种。Ga是从中药材高良姜的根茎中提取出的黄酮类化合物，具有广泛的生物活性如抗炎、抗氧化等。Ga还具有一定的抗癌作用，可以通过不同的途径抑制肿瘤细胞的进展如肝癌、肾癌、胶质瘤，但是Ga对于肺癌治疗的研究罕有报道。本研究用不同浓度的Ga处理肺腺癌A549、PC9细胞，初步探讨其对于肺腺癌细胞增殖、迁移能力的影响以及可能的作用机制。本研究表明，Ga抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移能力，且呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。

肿瘤细胞的能量代谢失衡是肿瘤细胞区别于正常细胞的特征之一。肿瘤细胞的生长依赖于糖酵解并在LDH的作用下生成少量能量以满足代谢需要。多种生物组分参与其中，如LDH、LD、葡萄糖、ATP等。研究显示肿瘤细胞的糖酵解与细胞增殖密切相关。本研究中，Ga处理肺腺癌细胞后，细胞的LDH活性降低，LD和ATP的生成量降低，并且均与Ga浓度有关，这提示Ga有可能是通过抑制肿瘤细胞的糖酵解，降低细胞能量供应，进而抑制肿瘤细胞增殖。

肿瘤的转移是另一特征，指的是肿瘤从原发部位转移到其他部位并形成新的肿瘤的过程。EMT是上皮细胞向间质细胞转化，使其失去细胞间黏附作用，以提高细胞活动性的过程。EMT被认为是肿瘤转移中的主要因素。目前已知的EMT标志蛋白主要包括上皮标志蛋白E-cad以及间质标志蛋白N-cad、vimentin(VIM)，并且EMT抑制过程常表现为E-cad表达量增高而N-cad、VIM表达量降低。本研究显示，当作用于肺腺癌细胞的Ga浓度逐渐增加时，E-cad蛋白表达量逐渐增高，而N-cad的表达量逐渐降低，这提示Ga有可能通过抑制EMT过程进而抑制肺腺癌细胞的迁移能力。

Yang et al研究表明胃癌细胞的增殖、迁移与糖酵解密切相关。Cao et al发现肺癌细胞外ATP能促进细胞迁移、侵袭，并且诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)、EMT相关蛋白等表达。Hou et al发现抑制肺癌细胞LDH-A的表达能够抑制EMT过程，伴有E-cad表达增加而VIM、N-cad等表达降低。细胞的生命活动离不开能量，而肿瘤细胞的能量代谢则依赖于糖酵解。结合本研究，Ga对于肺腺癌细胞迁移能力的影响可能不仅与EMT有关，还与糖酵解有关，但相关机制仍需进一步探讨。