L-半胱氨酸对慢性间歇性低氧大鼠血压和交感神经活动的影响

圣 豪，丁 扬，蒋 倩，余孝海，王烈成，钟明奎

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea, OSA)是一种累及多系统并造成多器官损害，严重威胁人类健康的常见睡眠呼吸障碍疾病。OSA是多种心脑血管疾病的独立危险因素，对患者造成的伤害不可逆转，包括高血压、冠心病、心律失常、肺动脉高压等，与OSA关系最为密切的是高血压。OSA的损伤机制和特点是间歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)，被认为是引起高血压等心脑血管疾病的最为重要的因素。交感神经的过度激活和血管内皮的过度损伤是造成高血压的重要因素。硫化氢( hydrogen sulfide，HS) 作为内源性信号分子在多个系统中均发挥重要的生物学作用。在心血管系统，HS在舒张血管、抑制血管重构和保护心肌等方面具有重要的生理作用，研究表明内源性HS和外源性HS供体化合物对高血压、动脉粥样硬化、心肌肥厚、心力衰竭和缺血/再灌注损伤等心血管疾病发挥保护作用。该研究旨在探讨应用HS前体L-半胱氨酸( L-cysteine, L-cys)对IH所致的高血压大鼠的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只体质量为(230±30)g的雄性SD大鼠由济南鹏跃实验动物繁育有限公司[证书编号SYXK(WAN)2017-006]提供，并在安徽医科大学动物设施中心饲养动物分笼饲养，动物饲养于12 h暗光循环标准条件下的实底聚丙烯笼子里，自由摄食和饮水，通风良好，温度(23±2)℃，湿度(55±5)%，光照时间7:00～19:00。

1.2 主要仪器及试剂

测氧仪(CYS-1型数字式测氧仪，上海精宏实验设备有限公司)；PowerLab 8/30数据采集分析处理系统(澳大利亚AD Instruments公司)；无创血压测定分析系统(ALC-NIBP，上海奥尔科特公司)；医用氧气(浓度>99.9%)、氮气(高纯氮气，浓度>99.99%)由合肥市医用氧气厂充装；L-半胱氨酸 (L-cysteine，L-cys)购自美国Sigma公司。

1.3 方法

1

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3

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1

间歇性低氧模型的制备及分组 所有实验大鼠均提前1周进行适应性饲养，随机分为正常氧(Control)组、慢性间歇性低氧(CIH)组、正常氧L-cys干预(Control+L-cys)组和慢性间歇性低氧L-cys干预(CIH+L-cys)组，每组10只。参照课题组前期实验，将CIH组和CIH+L-cys组大鼠放入低氧仓内，通过氮气稀释的原理，使低氧仓内的氧气浓度降为环境浓度的21%，并通过氮气和氧气控制仓内的氧气浓度。充入氮气4 min，使低氧仓的最低氧气浓度达到6%，并保持40 s，然后充入氧气5 min，以重新充氧至21%，并维持整个循环9 min。低氧仓的氧气浓度由氧气探头监控，开关时间由计时电路控制。进行间歇性低氧处理，每天8 h(9:00 am～5:00 pm)，连续15 d。对照组除了不放入低氧仓，其他处理与模型组相同。

1

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2

评价肾交感神经活动(renal sympathetic activity，RSNA) 腹腔注射乌拉坦(800 mg/kg)和α-氯醛糖(40 mg/kg)混合麻醉，从大鼠腰腹部行竖行切口暴露肾脏等组织，用眼科剪刀和镊子小心游离出肾交感神经，装上事先准备好的电极来引导RSNA，经数据分析系统分析后，记录数据并应用专业的数据分析系统分析处理RSNA，通过RSNA基础值占最大值的比例来评价RSNA的水平。

1

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3

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3

血浆中HS、去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、胱硫醚β

-

合酶(cystathionine β

-

synthase, CBS)和胱硫醚γ

-

裂解酶(cystathionine γ

-

lyase, CSE)检测 大鼠腹腔完全麻醉后，腹主动脉取血4～5 ml，肝素抗凝，离心10 min(3 000 r/min)，取上清液，-80℃保存。采用GENMED比色法测定血浆中HS的水平，ELISA法检测NE水平和CBS、CSE活性。

2 结果

2.1 L-cys对慢性间歇性低氧对大鼠血浆中H

S水平的影响

与Contol组相比，间歇性低氧15 d后，CIH组大鼠血浆中HS含量[

F

=9.975，

P

<0.01]显著降低；与CIH组相比，口服L-cys可显著增加大鼠血浆中HS含量[

F

=9.975，

P

<0.05)]，而L-cys对正常大鼠血浆中HS含量有升高趋势，但没有显著差异；4组大鼠血浆中CBS和CSE活性没有显著差异。见表1。

表1 慢性间歇性低氧对大鼠血浆中H2S含量、CBS和CSE活性的影响

2.2 L-cys对CIH大鼠血压的影响

从IH第5天开始，CIH大鼠尾动脉SBP比间歇性低氧前升高；与Contol组相比，间歇性低氧15 d后，CIH组大鼠血压显著升高[

F

=233.1，

P

<0.05]。口服HS前体L-cys，对于正常大鼠血压没有影响；L-cys可抑制间歇性低氧引起的升压作用(

P

<0.01)，但不能使慢性间歇性低氧大鼠的血压完全恢复正常(

P

<0.01)，见图1。

图1 L-半胱氨酸对大鼠血压的影响

2.3 L-cys对CIH大鼠交感神经活动的影响

与Contol组相比，间歇性低氧15 d后，CIH组大鼠RSNA[

F

=21.92，

P

<0.01]和血浆中NE含量[

F

=63.02，

P

<0.01]显著升高。口服 L-cys，对于正常大鼠RSNA和血浆NE水平没有影响；L-cys可抑制间歇性低氧引起的RSNA[CIH组

vs

CIH+L-cys组：

F

=21.92，

P

<0.05]和NE[CIH组

vs

CIH+L-cys组：

F

=63.02，

P

<0.05]增加的作用，但不能使CIH大鼠的RSNA [Control组

vs

CIH+L-cys组：

F

=63.02，

P

<0.01]完全恢复正常(图2)。

3 讨论

本研究显示间歇性低氧可引起大鼠动脉血压、交感神经活动和血浆NE水平显著增加，血浆HS水平降低，提示间歇性低氧引起的高血压可能与体内的HS水平下降有关；应用HS前体L-cys，增加内源性HS水平可抑制间歇性低氧所致的血压升高和交感神经活动过度激活。

间歇性低氧是OSA的主要病理生理学特点和损伤机制，其特点是：①低氧程度严重，最低动脉血氧饱和度可降至20 %或更低；② 血氧饱和度一天之内会经历巨大的变化，其幅度之大高于30%低于70%。人体对低氧条件的反应包括两个过程：损害和适应，相比较而言，持续低氧的损害要比间歇性低氧对人体的损害更低，且人体更难以适应间歇性低氧。为了研究间歇性低氧与大鼠血压升高的关系，Tamisier et al模拟OSA患者缺氧模式建立了间歇低氧实验模型，给志愿者循环吸入低氧气体(氧浓度13%，持续15 s，每2 min一次循环)，每天8 h，持续28 d，28 d后志愿者平均动脉压显著升高，停止吸入低氧气体后，血压仍可持续升高。Fletcher et al首先制作了可实施间歇低氧环境的实验舱，从动物整体和系统水平证实了间歇低氧确可诱发大鼠高血压。本实验采用的间歇性低氧模式为9 min发生一次低氧，每一循环间歇性低氧舱内的最低氧浓度达到6%左右，持续时间为45 s左右，连续低氧15 d，大鼠血压出现升高。

图2 L-半胱氨酸对大鼠交感神经活动的影响

大量的研究表明，高血压患者的主要特征之一是交感神经的过度激活，在高血压疾病整个发展过程中都起着重要的作用。本研究显示IH可引起大鼠RSNA和血浆中NE显著升高，提示交感神经的过度激活可能是IH引起高血压的发病机制之一。间歇性低氧会导致氧分压降低和二氧化碳潴留，从而刺激中枢和外周化学感受器导致交感神经兴奋性增加。有研究表明，OSA患者外周压力感受器的敏感程度与OSA的严重程度密切相关，表明IH能够同时刺激化学感受器兴奋和影响压力感受器的功能，从而共同参与睡眠期间交感神经的过度激活。交感神经活性过度增强，会导致外周脉管系统的血管收缩，从而引起血压上升，这些由于交感神经活性过度增强机体应激产生的反应会更进一步使血压升高。

内源性HS由L-cys通过以下3种关键酶合成，分别是：CBS、CSE和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)。HS 在舒张血管、抑制血管重构和保护心肌等方面具有重要的生理作用，并且与多种心血管疾病相关。L-cys在体内有许多代谢途径：不但可以通过氧化还原途径分解为半胱亚磺酸，随后半胱亚磺酸在酶的作用下代谢为牛磺酸(Tau)和CO或丙酮酸盐和无机硫(HS)；也可发生脱硫反应，产生丙酮酸盐和过硫化物。除了形成代谢物Tau外，所有L-cys分解代谢的路径中L-cys的碳链转化为丙酮酸，巯基转化为无机硫(HS)。前期实验表明IH可引起大鼠血浆中HS含量降低，口服L-cys可显著抑制IH引起的血压升高和交感神经过度激活，提示L-cys可增加大鼠体内HS的含量，而HS可以降低交感神经的过度激活，从而降低IH所致大鼠的高血压。

本研究的创新之处通过建立间歇性低氧动物模型，将整体和分子水平的研究有机的结合起来，综合应用心血管生理学、药理学、组织化学、分子生物学等多种技术方法解决问题。本研究的局限之处在于没有开展细胞方面的实验与动物实验相互验证。预计下一步通过细胞实验与动物实验相结合来验证L-cys增加内源性HS对间歇性低氧引起的大鼠高血压的影响及机制。