BEX1和BEX4在口腔鳞状细胞癌中的表达与临床意义

吴江恩，后 军 ，薛浩伟，胡玉坤，孙 明

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一种极为常见的发生于口腔部位的恶性肿瘤，约90%的口腔恶性肿瘤都是口腔鳞癌。DNA高度甲基化是口腔癌中抑癌基因失活的常见表观遗传机制，通过影响转录降低基因表达水平。脑表达X染色体连锁蛋白(the brain-expressed X-linked protein, BEX)是一种保守性较高的小分子蛋白家族，研究发现了包括BEX1、BEX2、BEX3、BEX4、BEX5在内的BEX蛋白家族，因为CG区域在BEX家族基因的启动子区中富集，导致这一家族的蛋白极易受到包括甲基化等在内的表观遗传学调节的影响，抑癌基因的启动子CG区域广泛甲基化是恶性肿瘤发生特性，亦是调节抑癌基因功能失活的主要方式。作为易受甲基化调节的小分子信号蛋白，在口腔鳞癌发生、发展过程中存在表达差异。目前研究表明其中BEX1在室管膜瘤、食管鳞癌、口腔鳞癌中低表达；BEX4在肺腺癌、胃癌、口腔鳞癌中低表达。该研究从BEX1和BEX4蛋白在口腔鳞状细胞癌患者中的表达水平，探讨其与口腔鳞癌发生、发展的关系，进而提供与口腔鳞癌的诊断相关的临床治疗依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

本实验收集了55例2015年1月—12月期间，安徽医科大学第一附属医院病理科与OSCC相关的石蜡包埋样本，同时选择了30例癌旁非肿瘤组织作为本次实验的对照组。患者在手术治疗前均未进行化学治疗或其他的抗肿瘤治疗，在手术后均未发生围术期死亡的问题。上述病例中，女性20例，男性35例；年龄32～85(64.57±6.54)岁；低分化17例，中分化18例，高分化20例 ；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移30例；舌癌25例，牙龈癌15例，颊癌15例；根据口腔癌和口咽癌的国际抗癌联盟(UICC)第8版TNM分类分期标准进行判断，其中有24例处于Ⅰ期，10例患者处于Ⅱ期，11例患者处于Ⅲ期，10例患者处于Ⅳ期。本次研究所选用的实验样本均经本院伦理委员会审批，且患者已经签署了知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗人BEX1抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，工作滴度1 ∶50；兔抗人BEX4抗体购自北京义翘神州科技股份有限公司，工作滴度1 ∶50；免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Olympus光学显微镜购自日本 Olympus 公司。

1.3 实验方法

所有免疫组化标本均经10%福尔马林溶液固定24 h，石蜡包埋机包埋组织，切成4 μm的连续切片，行免疫组织化学染色。采用免疫组化SP法，主要实验步骤如下：石蜡切片脱蜡和水化后，经柠檬酸钠溶液高压加热进行抗原修复 2 min，置室温下自然冷却，每张切片滴入3% HO作用10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。每张切片滴入非免疫动物血清，以减少非特异性染色。滴加一抗(BEX1、BEX4)4 ℃冰箱过夜孵育，每张切片经PBS清洗后滴加生物素标记的二抗，放入37 ℃温箱孵育30 min，滴加 DAB显色，再使用苏木精染色液对切片进行复染，常规脱水中性树脂封片，在镜下观察其染色状态。

1.4 结果判定

将细胞质中出现可见棕黄色颗粒状物质沉淀作为判断阳性BEX1与BEX4免疫反应的依据，同时计数出现阳性反应的细胞；随机选择5个未出现重复视野的组织进行免疫组化切片观察，同时计数所选视野内的细胞。以半定量积分法作为判断依据判断最终的结果，同时由2名资历较深的病理科医师对其进行打分，阳性细胞数处于70%～100%的计为3分；50%～70%区间的计为2分；10%～50%区间的计为1分；<10%的计为0分；而根据染色强度对其进行评分，棕褐色细胞为3分，黄褐色计为2分，浅黄色计为1分，未染色计为0分。假如细胞两项指标的乘积总分<3分记为阴性反应，≥3分为阳性反应。

1.5 Kaplan-Meier生存分析

Kaplan-Meier plotter是一个综合的在线平台，来源于数据库GEO、EGA和TCGA，21种癌症样类型评估54 000多个基因对生存的影响。本研究使用Kaplan-Meier绘图分析BEX1和BEX4在口腔鳞癌患者中的表达情况及预后的相关性。从TCGA数据库获得212例口腔鳞癌组织和287例癌旁非肿瘤组织中 BEX1 mRNA表达数据以及132例口腔鳞癌组织和367例癌旁非肿瘤组织中BEX4 mRNA 表达数据。

1.6 String-DB数据库

String数据库(https://string-db.org/)常用于对基因与蛋白质间的相互作用进行分析，该数据库中不仅涵盖了蛋白质间的间接功能相关性，同时也涵盖了蛋白质间的直接物理相互作用。该数据库不仅含有从PubMed及其他数据库中所挖掘的数据及相关实验数据，同时还含有通过生物信息学的方法进行预测的结果。在本次实验中，物种选择为“人类”，分别输入BEX1与BEX4，选择Medium 0.4的置信度，同时选择10的最大相互作用数。

1.7 统计学处理

应用SPSS 24.0软件进行统计分析。选用χ的检验方式对临床病理学参数与BEX1和BEX4蛋白的表达间的关系进行检验；使用Kaplan-Meier和Log-rank检验法分析 BEX1和BEX4表达量差异与患者预后的关系。以

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BEX1和BEX蛋白在OSCC组织及癌旁非肿瘤组织中的表达

在免疫组化实验中，BEX1和BEX4的表达定位于细胞质(图1)。BEX1和BEX4在癌旁非肿瘤组织阳性表达率明显高于OSCC阳性表达率 ，BEX1和BEX4在OSCC组织与癌旁非肿瘤组织相比差异均有统计学意义(

P

<0.01)(表1)。

图1 OSCC组织和癌旁非肿瘤组织中BEX1和BEX蛋白免疫组化结果SP×200

2.2 BEX1和BEX4表达与OSCC临床病理参数

之间的相关性

BEX1和BEX4蛋白的表达和OSCC的分化程度、是否出现淋巴结转移以及临床分期存在着一定的相关性，且其中的差异有统计学意义(

P

<0.05)，同时BEX1与BEX4蛋白的表达与患者的年龄、发病部位及性别等无相关性，见表2。

表1 BEX1蛋白和BEX4蛋白在OSCC组织和癌旁非肿瘤组织组织中的表达(n)

图2 基于BEX1、BEX4的总生存期Kaplan-Meier生存曲线

表2 BEX1和BEX4的表达与OSCC临床病理参数的关系[n(%) ]

2.3 BEX1和BEX4在OSCC中表达的关联性

关联性分析显示， BEX1和BEX4的表达关联强度为0.489(

P

<0.001), 差异有统计学意义(表3)。

2.4 BEX1和BEX4 Kaplan-Meier生存分析

使用生物信息学在线工具，利用Cox比例风险回归和通过绘制Kaplan-Meier生存图来计算基因表达与生存之间的相关性，结果(图2)表明BEX1低表达的患者生存率更差。BEX4表达与生存率无显著关系。

表3 BEX1蛋白和BEX4蛋白在口腔鳞癌组织表达关联性(n)

2.5 BEX1和BEX4相互作用蛋白网络

根据方法部分的输入，得到如下结果:BEX1:PPI富集

P

=0.001 55(图3)。其中在PPI网络中与BEX1相互作用的蛋白有OMP、TCEAL5、LDB2、LDB1、NHLH2、TRAF6、RIPK2、NGF等，在细胞周期和神经元分化中起作用。抑制对神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的神经元分化。BEX4:PPI富集

P

=0.000 258。其中在PPI网络中与BEX4相互作用的蛋白有TEX19、TCEAL7、MAP7D3、ATXN3L、FAM47B、SATL1、ITIH6等，主要参与了参与控制细胞周期进程和基因组稳定性。

3 讨论

发生于口腔位置的恶性肿瘤均可被称为口腔癌，其中最为常见的便是OSCC，OSCC常见于牙龈、颊等位置，患者的发病部位会出现硬结、溃疡等症状，晚期患者甚至可出现颈部淋巴结转移或肿瘤细胞的远处转移。BEX家族因子高度同源，多项研究发现BEX因子多位于细胞质、细胞核内，并可在不同细胞器间动态穿插，参与多种信号通路，推测其起到信号中介体作用。由于BEX家族基因启动子区富含CG区域，易受到甲基化等表观遗传学调节。现阶段关于抑癌基因的研究报道较少，近些年国内有学者研究发现E-cadherin在OSCC中的表达较癌旁组织显著降低，推测可能起到抑制癌基因的作用。本文研究BEX1和BEX4在口腔鳞癌中的表达情况，为口腔鳞癌的临床诊断提供帮助。

图3 BEX1和BEX4相关蛋白网络图

目前，Geng et al研究结果表明在食管鳞癌组织中BEX1蛋白的表达程度较低，且该蛋白的表达情况与T分期等情况呈负相关的关系。生存分析研究结果表明，BEX1蛋白表达水平较低，可提示食管鳞癌患者的术后预后效果较差。Zhang et al研究表明BEX家族在肺腺癌组织中的表达水平明显低于正常组织，BEX1、BEX4和BEX5的低表达水平与某些病理特征有关，尤其是在晚期肺腺癌中。生存分析表明，BEX家族成员，特别是BEX4，在临床早期和晚期都参与了肺腺癌患者的预后。这种表达模式可能作为肺腺癌患者诊断和预后的潜在标志物。Zhu et al研究表明BEX4在胃癌中低水平表达，BEX4低表达预测胃癌的生存率较差，它是诊断和预后胃癌的有价值的分子预测因子。

本研究分析了55例OSCC组织及30例癌旁非肿瘤组织中BEX1蛋白表达水平。结果显示45.45%的OSCC组织中BEX1蛋白阳性表达，BEX1蛋白表达水平在 OSCC中的表达较癌旁组织降低。Lee et al研究结果表明，在与咀嚼槟榔、抽烟及饮酒相关的OSCC标本中，BEX1蛋白的表达程度较低，且有着较为显著的甲基化程度，启动子甲基化使BEX1和LDOC1失活可能代表了OSCC分子发病机制中的关键，这与其研究结果基本相符合。其BEX4蛋白在OSCC组织中阳性表达为34.55%，且在中低分化、有淋巴结转移组明显低表达, 表明随着OSCC恶性程度的提高，BEX4表达水平越低，可能预示OSCC分期越晚。Gao et al研究显示，BEX4通过抑制口腔癌细胞增殖和生长而起到抑癌作用，BEX4的减少导致OSCC增殖倾向增加。本研究表明BEX1和BEX4蛋白的表达与OSCC分期、淋巴结的转移以及肿瘤分化程度相关，差异有统计学意义(

P

<0.001)。对BEX1和BEX4之间的相关性分析结果显示，OSCC组织中 BEX1蛋白表达水平与BEX4蛋白表达水平差异有统计学意义，关联强度为0.489(

P

<0.001)，说明分析BEX1和BEX4有助于OSCC患者的诊断及预后评价。通过GEPIA分析BEX1和BEX4表达水平对OSCC总体生存率的影响，显示BEX1低表达的患者其预后有较差的趋势，意味着更短的总生存期(

P

<0.05)，BEX4表达与总体生存率无显著关系。

综上所述，BEX1和BEX4在OSCC组织中低表达，且BEX1低表达提示OSCC患者预后较差，可能作为OSCC临床诊断及预后的关键因素。