DHEA与褪黑素在继发性早泄疾病中的表达及意义

李 虎，张 耀，高晶晶，张贤生,3

早泄(premature ejaculation，PE)是常见的男性性功能障碍疾病之一，不仅影响男性生活质量及精神方面，还影响着夫妻双方。PE可以分为4种类型：原发性PE(lifelong PE，LPE)、继发性PE(acquired PE，APE) 、变异性PE及主观性PE。脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)及褪黑素作为神经及内分泌系统的两大物质，在人体中发挥着重要作用。白天DHEA大量分泌对人体清醒及活动起着重要作用，傍晚DHEA的分泌逐渐减缓，松果体会开始让褪黑激素进行大量分泌，两者间形成微妙的消长。DHEA作为一种雄激素，对男女双方都有着一定的影响。近年来，褪黑素对男性生殖系统的影响也有报道。但DHEA及褪黑素在PE中的作用的研究却很少。 因此，该文通过对DHEA及褪黑素与APE的关系，并分析其与疾病严重程度的关系，进一步阐述DHEA及褪黑素在APE中的研究意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料

2020年5-10月从安徽医科大学第一附属医院泌尿外科及健康中心招募志愿者并提供参与研究的书面知情同意书。共有57例研究对象符合入组条件，其中APE有27例，无PE有30例。两组分为APE组和对照组。APE组年龄20～50(36.29±9.87)岁，IELT(2.55±0.73)min。对照组年龄20～49(31.48±10.77)岁，IELT(8.91±3.88)min。根据中国PE性功能评价量表-5(CIPE-5)评分，APE患者分为轻度7例，中度14例，重度6例。纳入标准：年龄在20至60岁之间，在过去6个月内有稳定的性生活,国际勃起功能指数(IIEF- 5)>22。排除标准：精神病或神经病史，骨盆/会阴部创伤，肝或肾功能衰竭，尿路感染，慢性前列腺炎，解剖异常以及可能影响性功能的慢性疾病。接受5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂、α-受体阻滞剂、磷酸二酯酶抑制剂、抗胆碱能药、抗精神病药和补充维生素D的参与者也被排除在研究之外。本研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

无水乙醇购自上海臻诺生物科技有限公司；TRIzol购自哈尔滨新海基因检测有限公司；氯仿购自上海穆百生物科技有限公司；异丙醇购自上海穆百生物科技有限公司；Rnase-free水购自泽叶生物科技有限公司。qPCR试剂盒购自北京启衡星生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；Elisa试剂盒购自江苏酶免实业有限公司；qPCR仪购自北京科誉兴业科技发展有限公司；低温离心机购自长沙巴溪仪器有限公司；酶标仪购自上海联迈生物工程有限公司。

1.3 方法

患者在研究开始之前被告知研究目的、内容及方法，如同意参加本研究将签署知情同意书，并在专业医护人员指导下填写调查问卷及标本采集的准备。问卷调查内容包括：PE诊断量表(PEDT)、CIPE-5、IIEF- 5、自我估计阴道内射精潜伏期(自我估计IELT) (从开始插入阴道到阴道内射精的时间)。

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标本采集及处理 研究对象均在隔夜空腹>8 h 后于第二天清晨7:00～8:00采集外周静脉血，在室内常温下静置 20 min，外周血进行离心，3 500 r/min、30 min，分离血清和外周血沉淀物，储存在-80 ℃环境下待测。

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外周血RNA的提取 向外周血沉淀物中加入1 ml TRIzol，15～30 ℃放置5min，每使用1 ml TRIzol加200 μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置3 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，样品分为3层，RNA主要在水相中，把水相(约500 μl)转移到新管中，在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放20～30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，去上清液，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀，加入1 ml 75%乙醇(Rnase-Free 双蒸水配制)洗涤沉淀，每使用1 ml TRIzol至少用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤，洗涤2次，风干沉淀，加入30～50 μl 双蒸水，溶解沉淀。

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反转录 使用AG反转录试剂盒对人体外周血提取出的RNA进行反转录实验，实验所有操作均在冰上进行，操作均严格按照说明书进行。使用反转录成功的cDNA进行后续的qPCR实验

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qPCR实验 使用Sigma 2X qPCR Master Mix对反应进行标准化。SYBR 2X qPCR预混液用于包含2 μl cDNA模板的反应混合物中：2 μl每种引物(每 μl全部含2.5 μmol/L的Piry-Forward和Piry-Reverse)； 0.4 μl的ROX缓冲液(2X)； 10 μl的SYBR缓冲液(2X)； 3.6 μl的Rnase-free水，用于20 μl的体积反应。反应条件：预变性95 ℃，变性95 ℃、10 s，退火58 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共计45个循环，最后绘制melt curve，记录CT值，计算表达量。

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ELISA检测 提前准备好待测的人体血清以及标准品，根据浓度进行不同比例的稀释，分别设空白孔、标准品孔和待测样品孔，在酶标板上标准品精确加样50 μl，待测样本孔中加稀释液40 μl，样本加10 μl，封板膜封板放37 ℃温育30 min，1x的洗涤液洗涤板子，重复5次，拍干，加入酶标试剂50 μl，空白孔除外，温育半小时，再次洗涤，随后在每孔加入显色剂A 50 μl，显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min，每孔加入终止液50 μl，终止反应，以空白孔调零，450nm波长测量各孔吸光度(optical density, OD值)

1.4 PE诊断及严重程度的评判标准

根据PEDT评分诊断是否属于PE(≥11分为PE，=9分或10分疑似PE，≤8分不属于PE)。存在PE的患者若符合国际性医学学会(ISSM)委员会对APE的定义标准，则诊断为APE。根据CIPE-5积分，PE患者可以分为轻度、中度、重度3种类型(轻度大于13分，重度10～13分，重度5～9分)。

1.5 统计学处理

应用SPSS19.0统计软件进行分析，数据首先进行正态性检验，如数据符合正态分布则采用

t

检验，否则采用Mann-Whitney U 检验。两变量若为正态分布数据采用 Pearson 相关分析，两变量若为非正态分布数据采用Spearman 相关分析。

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 比较APE组与对照组外周血DHEA及褪黑素受体基因的表达

选取30例对照组患者与27例APE患者的外周血，提取RNA进行反转录以及qPCR实验，来检测DHEA以及褪黑素受体在外周血中的基因表达，APE患者的外周血中DHEA的基因表达低于对照组(

P

<0.01)，褪黑素受体1的基因表达低于对照组(

P

<0.01)，差异均有统计学意义，见图1。此外，褪黑素受体2的基因表达量过低无法统计。

图1 对照组与APE组外周血DHEA及褪黑素受体1基因的表达差异与对照组比较：**P<0.01

2.2 比较APE组与对照组血清中DHEA及褪黑素分泌浓度的差异

选取30例对照组患者与27例APE患者的外周血，离心取血清，进行ELISA实验检测血清中DHEA以及褪黑素的分泌浓度，显示APE患者血清中DHEA分泌的浓度低于对照组[(4.84±2.07)ng/ml

vs

(6.19±1.78) ng/ml，

P

=0.011]，血清褪黑素的分泌浓度也低于对照组[(5.55±2.30) pg/ml

vs

(13.36±2.78) pg/ml，

P

<0.001]，差异均有统计学意义,见图2。

图2 对照组与APE组血清中DHEA及褪黑素分泌浓度的差异与对照组比较：*P<0.05，***P<0.001

2.3 分析APE患者血清中DHEA及褪黑素的浓度与APE疾病严重程度的相关性

选取APE组患者外周血DHEA及褪黑素的分泌浓度与CIPE-5评分进行分析，显示APE组患者血清中DHEA的浓度与CIPE-5评分不相关(

r

=0.154 6，

P

=0.441 3),但褪黑素浓度的变化与CIPE-5评分相关，差异有统计学意义(

r

=0.773 8，

P

<0.05)，见图3 。

图3 APE患者血清中DHEA及褪黑素的分泌浓度与APE疾病严重程度的相关性

3 讨论

在PE疾病中，APE相比于LPE更为常见，然而其影响因素及病理机制尚未完全阐述。针对APE的治疗，除了针对已知病因进行治疗，还包括药物治疗、行为心理治疗、手术治疗等。目前，药物治疗有几种选择，如5-HT再摄取抑制剂(达泊西汀、氟西汀、帕罗西汀等)和局部麻醉剂，已在临床上广泛使用。虽然一些研究表明这些方法取得了显著的成功，然而也有一定的副作用，包括恶心和腹泻、头痛、头晕、性欲减退、无射精、勃起功能障碍。与此同时，行为心理疗法的结果是不受控的，手术治疗也仍处于探索阶段。在临床上，APE的男性比LPE的男性更有可能寻求医学治疗。本研究通过分析DHEA及褪黑素与APE的关系，寻找新的病理生理因素，进而阐明这种性功能障碍的潜在原因，从而发现新的治疗靶点。

本研究中，APE组与对照组外周血的DHEA基因表达及血清中分泌的含量，均具有显著差异，这在一定程度上说明了DHEA在APE的发生与发展过程中起到了一定的作用。DHEA是一种神经活性类固醇，通过调节5-HT、DA和去甲肾上腺素的释放而具有神经生物学作用。在前脑，DHEA作为神经甾体，负调节GABA受体的功能从而可以激活5-HT神经元的活动。5-HT作为神经递质，在PE的发生发展过程中具有重要作用。中枢神经系统存在着5-HT神经元，释放5-HT到突触间隙，大部分被突触前神经末梢重摄取，进入囊泡再贮存，另一部分则被线粒体膜上的单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)所氧化。有研究为了探讨DHEA是否调节DA和5-HT的代谢，通过对大鼠给药后2 h后检测大鼠纹状体(corpus striatum，CS)和伏隔核(nucleus accumbens，NAc)中神经递质及其代谢物的含量，发现DHEA治疗显著降低了CS的DA周转(高达33%)，但增加了5-HT周转(高达76%)，MAO活性也降低了。临床上，通过给予抑郁症患者5-HT再摄取抑制剂，可以显著提高血清中DHEA的浓度，表明内源性DHEA在5-HT系统中可能存在相互作用。

此外，本研究显示，APE的人群中褪黑素受体1基因的表达与血清褪黑素分泌浓度与对照组对比显著降低，显示APE的病因与褪黑素的改变可能存在一定的相关性。褪黑素是一种5-HT衍生的吲哚胺，在交感神经的控制下于夜间合成。它的生产是通过5-HT的乙酰化和甲基化合成的。色氨酸羟化酶作为5-HT的合成限制酶，在松果体细胞中也可以表达，然而5-HT的代谢途径和褪黑素的关系尚未得到很好的阐述。在以往的研究中，褪黑激素水平被观察到在焦虑、睡眠剥夺和情绪低落的情况下会降低，而这些疾病也都于中枢5-HT系统的紊乱有关。最近有研究通过对LPE的病人口服5-HT再摄取抑制剂进行治疗，发现血液褪黑素浓度显著升高，表明5-HT的摄取与褪黑素的合成具有相关性。此外，本实验分析了血清中褪黑素浓度与CIP-5评分显著相关(

r

=0.773 8，

P

<0.05), 然而DHEA与CIPE-5评分无相关性，提示血清褪黑素浓度的变化可作为APE疾病严重程度的标志物。

综上所述，APE与DHEA以及褪黑素具有密切的关系，DHEA与褪黑素在APE的发生与发展过程中起到重要作用。DHEA通过调控5-HT神经元活动来影响5-HT的含量，可能会导致APE的发生。褪黑素作为5-HT的产物或许可以反映中枢系统中5-HT含量的变化以及进一步调节5-HT系统。这些内在可能存在的机制需要深入研究，进而为APE的治疗提供新的方向。