高盐环境对大鼠冠状动脉平滑肌钙库操纵的钙内流及其介导的收缩功能的影响

何 可，肖 慧，卢昊阳，代曼玉，沈 兵，赵 韧

膳食钠摄入量增高，冠状动脉痉挛和缺血性心脏病的风险增加，这与冠脉血管反应性的变化有关。研究证实，高盐饮食使血管床对激动剂的反应性增强。盐敏感性高血压会引起细胞外液中的钠水潴留，神经体液因素通过冠脉内受体机制影响血管张力。有研究发现血栓素及内皮素受体下游IP受体-SOCE途经关键性调节了小动脉血管张力。钙库操纵的钙内流(store-operated Caentry，SOCE)保持内质网Ca的稳态，是维持血管平滑肌(vascular smooth muscle cells，VSMCs)收缩功能的重要环节。虽然高盐饮食可能导致血管反应性及细胞外Na浓度的暂时性增加，但其是否改变SOCE介导的冠脉收缩及其Ca内流机制尚不清楚。该研究旨在讨论细胞外高盐环境对冠状动脉收缩功能的影响，为高血压相关缺血性心脏病临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

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动物 本研究中所用大鼠均严格遵守《中华人民共和国实验动物管理条例》，并已得到安徽医科大学动物伦理委员会的允许。实验用动物为体质量300 g左右清洁级雄性SD大鼠。所有实验大鼠均于25℃左右通风环境下自由活动、饮食。

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试剂与仪器 Orai1、ET抗体购自美国Affinity Biosciences公司；STIM1抗体购自美国GeneTex公司；U46619购自美国Sigma公司；ET-1购自美国MedChemExpress公司； Pluronic F-127购自美国Invitrogen公司；微血管张力检测仪(DMT620M)购自丹麦 Danish Myo Technology A/S 公司；体式辅助显微镜购自日本奥林巴斯株式会社；荧光显微镜(Nikon T200)购自日本尼康公司。Krebs液(mmol/L) NaCl 118、KCl 4.7、CaCl2.5、KHPO1.2、MgSO·7HO 1.2、NaHCO25.2、CHO11.1；高钾溶液(mmol/L) NaCl 58、KCL 60、CaCl2.5、KHPO1.2、MgSO·7HO 1.2、NaHCO25.2、CHO11.1；1 mol/L NaCl溶液。

1.2 方法

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冠状动脉环的制备 大鼠用CO窒息处死后，手术剪打开胸腔，取出心脏后置于灭菌 PBS 液中轻轻挤压排出血液，在显微镜下仔细剥出冠状动脉，分离周围肌肉组织，注意不要钳夹及牵拉血管。分离出的冠状动脉剪成4段1.8～2.0 mm长的血管环，用细金属丝去除血管内皮。整个分离过程要在4℃冰浴且不断通有95% O和5% CO混合气体的条件下进行。

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离体血管培养 用无菌PBS将游离的冠状动脉血管环洗3次后放入含10%胎牛血清的1640培养基中，分别加入10、20、30、40 μl的1 mol/L NaCl溶液，放进培养箱培养24 h后进行离体血管张力实验。

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离体血管张力实验 在DMT张力仪的浴槽中预置5 ml Krebs液并通有95% O和5% CO混合气体，维持温度在37 ℃，将培养的冠状动脉血管环用细钢丝固定于浴槽中。调节张力换能器给血管施加2 mN的基础张力，利用 Powerlab 生物信号记录系统记录血管张力的变化。待血管在Krebs液平衡1 h且张力稳定后，用60 mmol/L高钾溶液激动血管2次，待达到最大收缩效应时，用Krebs液冲洗3次至基础张力，每次间隔5 min。为检测血管内皮活性，用1 μmol/L的U46619刺激血管收缩，维持5 min后用1 μmol/L Ach诱导血管舒张，若舒张幅度小于20%，则说明内皮去除良好，方可进行后续实验。洗脱4次至基线张力后，依次用U46619(0.01～3 μmol/L)、ET-1(1～300 nmol/L)诱导血管进行浓度依赖性收缩，观察并测定其张力变化。在SOCE诱导的收缩实验中，首先用不含CaCl的Krebs液冲洗3次以清除细胞外Ca，每次间隔5 min，然后加入1 μmol/L维拉帕米和100 nmol/L ET-1孵育10 min以耗尽内质网中存储的Ca，记录CaCl(1～10 mmol/L)诱导的血管浓度依赖性收缩。

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钙成像实验 大鼠冠脉平滑肌细胞株(rat coronary arterial smooth muscle cells，RCASMCs)传代种板于30 mm玻璃盖玻片上。分别用含137.65 mmol/L和157.65 mmol/L NaCl的完全培养基培养24 h后进行细胞钙成像实验。用含6 μmol/L Fluo-8 AM和0.02% Pluronic F-127的培养基孵育细胞30 min，随后在不含Ca的OPSS缓冲溶液中用4 μmol/L毒胡萝卜素(thapsigargin，TG)处理10 min以耗竭内质网中Ca存储，随即添加2 mmol/L CaCl诱导细胞外Ca内流。在荧光显微镜下检测和记录荧光，Fluo-8的激发和发射波长分别为488和515 nm。将添加细胞外Ca之后与添加之前的荧光强度之比(F/F)作为[Ca]i变化量。

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免疫组织化学实验 大鼠离体冠状动脉用不同浓度高盐培养基(分别含137.65～167.65 mmol/L NaCl)培养24 h后，取出并固定于4% 多聚甲醛中。脱水并包埋成组织蜡块后切成5 μm厚的切片。经脱蜡、水化、修复抗原后用0.3%过氧化氢处理以封闭内源性过氧化物酶，室温下用10%山羊血清封闭30 min。随后加一抗，在4℃下孵育过夜。室温复温30 min后用PBS冲洗，室温下用二抗孵育30 min，经 DAB 显色后用苏木精对切片进行复染，流水冲洗后用显微镜观察是否染色完全，烘干后用中性树脂封片晾干，镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 高盐培养对U46619和ET-1诱导的冠状动脉血管收缩的影响

采用累积给药法加入U46619 (0.01～3 mmol/L)或ET-1(1～300 nmol/L)，可诱导大鼠冠状动脉产生浓度依赖性收缩。与对照组(培养基中NaCl浓度为137.65 mmol/L)相比，大鼠冠脉在高盐培养后(培养基中NaCl浓度为147.65～167.65 mmol/L)由U46619所引发的血管浓度依赖性收缩增强(

P

<0.05)，见图1A及表1。由ET-1所引发的血管浓度依赖性收缩也增强(

P

<0.01)，见图1B及表2。这一结果表明，细胞外高盐环境可增强激动剂诱导的大鼠冠状动脉的收缩功能。

图1 高盐培养对激动剂诱导的冠状动脉收缩的影响

2.2 高盐培养对SOCE诱导的冠状动脉血管收缩的影响

结果如图2及表3所示，与对照组相比，高盐培养后SOCE诱导的冠状动脉浓度依赖性收缩增强(

P

<0.01)。

图2 高盐培养对SOCE诱导的冠状动脉收缩反应的影响与137.65 mmol/L [NaCl] 组比较：**P<0.01

2.3 高盐培养对RCASMCs中SOCE介导Ca

内流的影响

为了探究高盐环境下SOCE介导Ca内流的变化，选取使冠状动脉收缩最强的高盐浓度(培养基中NaCl浓度为157.65 mmol/L)处理RCASMCs 24 h后做钙成像实验，结果如图3所示，与对照组(F/F=2.70±0.43)相比，高盐培养(F/F=4.32±0.59)使RCASMCs中SOCE介导的Ca内流增强(

t

=4.477,

P

<0.01)。

图3 高盐培养对RCASMCs中SOCE介导的Ca2+内流的影响

表1 高盐培养对U46619诱导的冠状动脉收缩的影响

表2 高盐培养对ET-1诱导的冠状动脉收缩的影响

表3 高盐培养对SOCE诱导的冠状动脉收缩的影响

图4 高盐培养后冠状动脉免疫组化结果 ×400

2.4 IP

R-SOCE相关蛋白的分布和表达

结果如图4所示，用免疫组织化学方法对不同浓度高盐培养后的离体冠状动脉进行染色，放大400倍视野观察，Orai1、STIM1、IPR和ET于冠状动脉平滑肌层均有分布，与对照组相比，高盐培养后，Orai1、STIM1和IPR的表达增强(

P

<0.05)，ET的表达有增强趋势，但差异无统计学意义。

3 讨论

现有证据表明钠摄入量与血压值之间存在直接关系，过量的钠摄入已被证明会引发血压的显著增加，并与缺血性心脏病的发病及其心血管并发症有关。高钠摄入及血压水平升高与保水、全身外周阻力增加、内皮功能改变、大弹性动脉结构和功能改变、交感神经活动改变、心血管系统自主神经调节有关。一些研究表明，在高钠摄入期间，体内钠含量的增加虽然很小，也许是暂时的，但仍可能高于低钠摄入期间，无论是在人类还是在实验模型中，钠可能在体内积累，而不伴随着水的滞留。此外，虽然体内钠可能增加的位置尚不清楚，但一些钠可能存在于细胞内，而很大一部分可能在细胞外液中。最近的研究表明，钠血浆水平的变化不仅对小阻力动脉产生影响，而且还可能影响大弹性动脉的功能和结构。

生理情况下，当第一信使(如内皮素和血栓环素)激活细胞膜上G蛋白偶联受体，下游第二信使1，4，5-三磷酸肌醇(IP)激活内质网上的 IPR引起内质网中的Ca释放到胞质中引起血管收缩，钙库操纵的钙通道(store-operated calcium channel，SOCC)是细胞膜钙通道的一种，其开放与胞内钙库的释放密切相关，是血管收缩机制之一，而Orai1、STIM1是SOCE作用的关键蛋白。病理情况下冠状动脉的粥样硬化处由于内皮损伤和血小板聚集后能够释放如内皮素和血栓环素等强烈的缩血管因子，通过G蛋白偶联受体发挥收缩血管的作用，导致局部严重的冠脉痉挛，因此G蛋白偶联受体-IPR-SOCE作用是调节冠脉血管张力不可忽视的因素。血管平滑肌细胞的增殖、迁移的调节都与SOCE密切相关，更有动物研究表明在肺动脉高压以及自发性高血压的疾病大鼠，肺动脉及胸主动脉收缩张力增加与SOCE作用增强有关。

ET-1对血管平滑肌上ET受体的主要作用是促进血管收缩、高血压、纤维化、炎症改变以及动脉粥样硬化。缺血性心脏病患者冠状动脉ET和ETB受体水平显著高于充血性心衰患者及正常对照组。高盐诱导高血压大鼠的外周小动脉收缩张力显著增加，而SOCE介导的血管收缩对脑基底动脉张力的调节起重要作用。有研究证明了血管激动剂介导的SOCE信号通路在冠状动脉血管收缩中的作用，发现IPR-SOCE 蛋白水平与冠脉的收缩张力呈现正相关性。本研究显示高盐培养离体冠脉后，激动剂(U46619、ET-1和CaCl)诱导的血管收缩力增强, SOCE介导的Ca内流增强，冠脉平滑肌层G蛋白偶联受体ET和下游IPR上调，SOCE蛋白(STIM1和Orai1)上调。所以本实验中冠脉收缩增强可能由于细胞外高盐环境引起IPR-SOCE蛋白水平升高及SOCE介导的Ca内流增强有关。

有研究发现生理范围内细胞外NaCl浓度增加可通过Na/Ca反向交换促使Ca进入细胞(而不是内钙释放)从而增强5-HT诱导的冠脉收缩，而细胞外NaCl浓度进一步升高时由于离子张力增加冠脉血管张力却是下降的。本研究中在NaCl浓度为137.65～157.65 mmol/L时，随着盐浓度的提高，激动剂诱导的冠脉收缩依次增强，Orai1、STIM1和IPR蛋白在冠状动脉平滑肌的表达依次上调，而当盐浓度进一步提高到167.65 mmol/L时，激动剂诱导的冠脉收缩较低浓度NaCl组反而有所下降，相应的蛋白表达下调，这可能与离子强度的过度增加有关，并可能掩盖细胞外NaCl的生理增加对冠状动脉血管收缩的显著影响。