不同碘营养水平对大鼠RASSF1A基因甲基化的影响

汪靓婧，董小婉，吴 翌，许 敏，王佑民

碘对维持正常的甲状腺功能起重要作用，高碘和低碘都会增加甲状腺疾病的发生率。缺碘会造成碘缺乏病，高碘会造成高碘性甲状腺肿、甲状腺功能亢进和自身免疫性甲状腺炎等疾病。目前, 碘的负效应成为内分泌学界和地方病学界共同关注的问题。Ras相关区域家族1 A(ras-association domain family 1A, RASSF1A)是一个位于人类3号染色体短臂(3p21.3)上的抑癌基因。RASSF1A基因几乎在所有组织中都有表达，近年来，RASSF1A基因甲基化在肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺癌等肿瘤疾病中的研究日益增多。目前，有关不同碘营养水平对RASSF1A基因甲基化影响尚未见报道。该研究采用动物实验方法，对不同碘饲养状态的大鼠RASSF1A基因甲基化率进行了对比分析，以探讨RASSF1A基因甲基化与碘营养状态的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

主要试剂：碘化钾试剂(天津市凯通化学试剂有限公司)，血清游离三碘甲腺原氨酸(free 3,5,3′-L-triiodo-thyronine, FT3)、游离甲状腺激素(free 3,5,3′,5′-L-tetraiodo-thyronine, FT4)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)检测试剂盒(德国西门子医学诊断股份有限公司)，基因组甲基化处理试剂(德国Qiagen生物公司)、组织基因组提取试剂盒和凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)。主要仪器：纯水仪(杭州中灿科技有限公司)，德国西门子医学诊断有限公司化学免疫分析仪(型号: ADVIA centaur XP)，电泳仪(北京六一仪器公司)，PCR扩增仪(Eppendorf 公司)。

1.2 动物分组与建模

选取40只SPF级雌性SD大鼠(日龄35～40 d, 体质量150～170 g)，购自安徽医科大学动物实验中心，合格证号：NO. 340000200001326。40只大鼠随机均分为5组：低碘(LI)组、正常碘(NI)组、5倍高碘(5HI)组、10倍高碘(10HI)组、20倍高碘(20HI)组。均饲以低碘饲料(含碘量<50 μg/kg)。根据国内学者总结的经验，完善大鼠碘过量及碘缺乏模型构建。LI组饮用去离子水(含碘量0 μg/L)，余各组饮用加KI的去离子水。以大鼠每日进食20 g，进水20 ml估计每只大鼠每日的总摄碘量，分别为LI组<1.00 μg; NI组6.15 μg; 5HI组30.75 μg; 10HI组61.50 μg; 20HI组123.00 μg。每个月收集1次各组大鼠24 h尿样，采用 ICP-MS(电感耦合等离子体质谱法)测定每组的尿碘水平，评价各组的碘营养状态。饲养3个月后处死大鼠，留取动脉血和甲状腺标本。血标本送至内分泌科实验室，采用化学发光免疫分析方法测定血清FT3、FT4、TSH水平。

1.3 甲基化率测定

亚硫酸氢盐处理后测序法进行检测。在Genebank内检索出大鼠RASSF1A的基因序列(GenBank ID: 363140)，经MethPrimer软件检测，大鼠RASSF1A基因启动子区域共有2个符合条件的CpG岛(见图1)，分别记为C1和C2。C1的序列长度为281 bp，包含11个CpG位点，C2的序列长度为448 bp，包含44个CpG位点。RASSF1A的引物设计见表1。PCR反应体系30 μl，上下游引物均各为1 μl，扩增条件为95℃预变性10 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、40 s，40循环，72 ℃延伸5 min。用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 引物信息

2 结果

2.1 不同碘营养状态与尿碘的关系

Spearman分析显示，各组大鼠的平均尿碘与碘摄入成正相关(

r

=+0.598,

P

=0.021)。但与NI组比较，各高碘组平均尿碘并未达到相应的倍数差，见表2。

表2 各组大鼠尿碘

2.2 不同碘营养状态与血清甲状腺激素水平的关系

饲养3个月后，FT3与碘浓度呈负相关(

P

<0.05)。而FT4、FT3/FT4、TSH与碘浓度差异均无统计学意义。但从总的变化趋势上看，低碘组和高碘组FT3均较NI组降低，结果差异有统计学意义。FT4均较NI组升高，但差异无统计学意义，TSH各组间未见显著变化趋势，见表3。

表3 大鼠血清甲状腺激素水平变化

2.3 不同碘营养状态与RASSF1A基因启动子区甲基化的关系

设定各CpG岛的平均甲基化率=CpG岛甲基化的CpG个数/该CpG岛总 CpG 个数；总甲基化率=(C1甲基化的CpG个数+C2甲基化的CpG个数)/(C1+C2总CpG个数)，经不同碘营养处理3个月后，BSP法检测显示，无论实验组还是对照组，在C1区域均呈现较高程度的甲基化，在C2区域则呈现较低程度的甲基化。各碘浓度组与正常碘组对比，无论C1启动子区域(

P

=0.630)、C2启动子区域(

P

=0.401)还是总的启动子区域(

P

=0.398)甲基化率，差异均无统计学意义，见表4。但通过绘制线型图，从总体趋势上看无论低碘组还是高碘组，各启动子区域的甲基化率均比正常组低，且在C1区域甲基化率从5倍高碘到20倍高碘呈现先降低后升高的U型趋势，见图2。

3 讨论

碘对甲状腺激素合成的作用受碘摄入量及作用时间影响，碘过量早期时机体存在一定代偿功能，甲状腺上皮通过钠-碘转运体等自主调节方式减少对碘的摄取，以调控激素的合成与释放，但长期碘过量也会出现失代偿。碘缺乏早期，在组织脱碘酶的作用下T4会更多的转化为T3，这种转化具有明显的适应代偿意义，但长期碘缺乏会使机体T3降低，最终出现甲减表现。本研究中LI组FT3较NI组降低，FT4比FT3升高，考虑存在早期的失代偿。而高碘的调控机制相对复杂，秦贵军 等对小鼠高碘饲养5个月后，本研究结果与之相似，高碘组的FT3低于正常组，而FT4高于正常组，作者认为这种现象可能与碘抑制5′-脱碘酶，从而阻止T4向T3分解有关，且这种抑制超过了高碘对甲状腺激素释放的抑制，故未出现特征性T3、T4降低，反馈TSH升高的血清改变。

图1 大鼠RASSF1A基因启动子区域的BSP分析结果

表4 各组基因甲基化比率

图2 各组甲基化率均值线性图

目前关于碘营养水平对基因甲基化影响的研究甚少，仅在近年略有增加趋势。Kim et al通过对临床患者进行尿碘采集，将患者分成不同的碘营养状态组，发现低碘和高碘摄入都是导致BRAF基因突变的危险因素。Guo et al尝试通过动物造模的方法去探究碘过量是否会影响小鼠甲状腺T淋巴细胞和B淋巴细胞DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferases, DNMTs)的表达。结果在对比高碘和对照组后，DNMT基因的甲基化率、mRNA和蛋白表达水平均未见显著差异。但Serrano-Nascimento et al通过细胞实验得出了相反的观点，他们认为碘过量可以使DNMTs表达增加，且伴随组蛋白H3的高甲基化和低乙酰化。在有限的关于碘与基因甲基化的研究中，可知碘可能会对BRAF和组蛋白H3基因甲基化造成影响。RASSF1A是近年来研究较热门的一个抑癌基因，目前认为它的抑癌作用可能与导致细胞周期停滞、促进细胞凋亡和降低肿瘤细胞的致瘤相关。RASSF1A启动子区域甲基化与甲状腺癌的易感性和无病生存率密切相关，是甲状腺肿瘤发生的一个早期步骤。现有的研究表明吸烟、病毒感染、过量雌二醇、氯乙烯和镍暴露等会对RASSF1A基因甲基化造成影响。但关于碘对RASSF1A基因甲基化的影响仍是未知的。

本实验结果存在3种可能：①碘与RASSF1A基因甲基化无关。既往已有研究表明小鼠在3个月的高碘诱导下DNMTs表达组间无明显差异。DNMTs是机体调节基因甲基化的重要途径，基因甲基化率增减可能伴随一定DNMTs改变。在此基础上可以推测，短期低或高碘与RASSF1A基因甲基化无关。但影响基因甲基化的因素不止DNMTs，还包括miR和基因间相互影响，故存在另一种可能。②碘可以影响RASSF1A基因甲基化，但目前处于代偿期。基因甲基化会受到感染物种类、浓度和感染时间的影响。国内学者在用氯乙烯染毒大鼠早期未发现阳性差异，延长染毒时间后，高剂量组RASSF1A基因才出现甲基化率升高，且呈先降后增的趋势。本实验在饲养3个月后，C1、C2区域无论高碘还是低碘组，甲基化率都比正常组低，C2区域高碘组甲基化率呈现先降后增的U型趋势。这与续志斌 等和张慧霞的实验结果有类似之处。作者也对这种“反常”的降低做了推测，在染毒早期机体通过DNMTs、miR等的异常表达，使启动子区甲基化水平下降，从而发挥基因的抑癌作用。故染毒早期不一定表现甲基化率升高，反而可以因为抑癌作用出现甲基化率下降。③其他因素：不同肿瘤存在不同的甲基化热点位点。Volodko et al认为RASSF1A基因在乳腺癌中甲基化热点仅限于11个CpG位点，余与乳腺癌的发生无关。张杰兴发现RASSF1A第104位CpG是镉促进人肝癌细胞增殖的关键点。碘是否仅对甲状腺特定CpG位点产生影响仍有待如焦磷酸测定等定量检测去进一步判断。

综上所述，在用不同碘浓度饲养SD大鼠3个月后，各组大鼠的血清FT3值随着碘浓度升高而降低，但FT4、TSH值在各组间无明显差异。3个月的碘诱导，各组间RASSF1A基因甲基化率差异无统计学意义，碘可能对RASSF1A基因甲基化无影响或机体处于代偿期。