抑制miR-128-3p表达对油酸致大鼠肺损伤的保护作用研究

龙光文，张 谦，杨秀林，吉春玲，董裕康

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一种非心源性因素诱发的急性肺水肿，是以严重低氧血症、呼吸窘迫、肺顺应性下降为主要临床特征的肺部急性炎症性综合征。MicroRNA(miRNA)是一类长度为20～25个核苷酸的非编码RNA分子，主要参与调控细胞增殖、迁移及凋亡等过程。近些年的研究显示，miRNA可以作为ARDS诊断的生物标志物或治疗靶点。且Huang et al研究发现，miR-128-3p在ARDS大鼠模型肺组织中高表达。提示，miR-128-3p在ARDS疾病发生过程中可能起重要作用，但其作用机制还有待进一步探讨。该研究拟通过尾静脉注射油酸的方法建立肺损伤大鼠模型，探讨miR-128-3p在肺损伤大鼠肺组织中的表达变化及下调miR-128-3p表达对模型大鼠肺组织的保护作用及可能作用机制，以期从基因层面为ARDS治疗提供理论依据及新的小分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性SD大鼠100只，鼠龄6～7周，体质量(220±10)g，由贵州医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK(黔)2018-0001。油酸购自湖南长沙恒昌化工有限公司；miR-128-3p拮抗剂(antagomir)及其阴性对照(antagomir NC)购自广州锐博生物科技有限公司；Nrf2抑制剂ML385购自美国Selleck公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；组织活性氧(reactive oxide species，ROS)检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；E2相关因子2(E2 related factor 2，Nrf2)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1

动物造模与分组 100只SD大鼠随机分成假手术组(sham组)、模型组(Model组)、antagomir NC组(NC组)、miR-128-3p antagomir组(antagomir组)和miR-128-3p antagomir+Nrf2抑制剂ML385组(antagomir+ML385组)，每组20只。其中antagomir组和NC组在造模前1 h，采用微量注射器经颈部气管注射antagomir或antagomir NC(根据相关文献和预实验结果确定给予剂量为40 nmol/只)，antagomir+ML385组在antagomir组的基础上给予30 mg/kg ML385腹腔注射，而sham组和Model组注射等量生理盐水。随后除sham组，其他各组大鼠均参考文献采用尾静脉注射油酸(0.15 ml/kg)的方法建立肺损伤模型。造模后若大鼠呼吸频次增加，动脉血液氧合指数(oxygenation index，OI)<200 mmHg，表明造模成功。造模成功24 h后处死大鼠，收集样本检测。

1.2.2

动脉血氧分压(partial pressure of oxygen，PaO)、OI测定 分离大鼠股动脉，取股动脉血1 ml，立即进行血气分析，记录PaO，根据吸入气中的氧浓度分数(fraction of inspiration O，FiO)计算OI，OI=PaO/FiO。

1.2.3

肺组织湿/干重比值(W/D)计算 取大鼠右肺中叶组织，滤纸吸干表面水分，称湿重(W)，将肺组织置于80 ℃烘箱72 h至恒重，称其干重(D)，计算肺组织W/D。

1.2.4

ELISA检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量 实验结束后结扎各组大鼠右主支气管，用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)灌洗支气管肺泡，反复灌洗3次并收集BALF，采用ELISA法检测BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的光密度(optical density，OD)值，根据标准曲线计算各指标含量。

1.2.5

比色法测定肺组织中SOD活性及MDA和ROS水平 收集各组大鼠左肺部分组织，根据RIPA裂解液使用说明书制备肺组织匀浆，用玻璃匀浆器上下、旋转充分碾磨，在冰上充分裂解后于12 000 r/min离心20 min取上清液，按照试剂盒操作说明书加入相应试剂，孵育后测各样品吸光度值，根据说明书提供的计算公式分别计算肺组织中SOD活性及MDA和ROS水平。

1.2.6

苏木精

-

伊红染色法(hematoxylin

-

eosin staining，HE)观察肺组织病理变化及评分 取大鼠右肺下叶，10 %甲醛固定，冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋后切片，HE染色，光镜下观察病理学结果，并对肺损伤程度进行评分：从肺泡水肿、肺间质水肿、中性粒细胞浸润、肺泡充血4个方面，损伤程度由轻到重依次标记为0、1、2、3、4分，累计总分为最终损伤评分。

1.2.7

反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测肺组织中miR-128-3p表达水平以及Nrf2和HO-1的mRNA水平 取各组大鼠的适量左肺组织，采用TRIzol法提取各样本的总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，取总RNA 2 μg 按照逆转录试剂盒提供的方法合成cDNA，引物序列见表1。取10 μl逆转录产物进行PCR反应，反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。以U6和GAPDH为内参，采用2法计算各基因mRNA相对表达量。

表1 引物序列

1.2.8

Western blot检测肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平 收集各组大鼠部分左肺组织用于蛋白质提取，采用BCA法测定肺组织中蛋白浓度。

向SDS-PAGE通道中加入等体积蛋白质，并将蛋白质转移到PVDF膜上，随后5%脱脂牛奶封闭。PBS洗涤3次，加入一抗Nrf2、HO-1和GAPDH一起孵育过夜，PBS洗涤后，将膜进一步与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗一起孵育，通过增强的化学发光法使膜上的条带可视化。采用Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度分析，以GAPDH为内参计算各蛋白相对表达量。

1.2.9

荧光素酶报告实验检测miR-128-3p与Nrf2的靶向作用关系 利用TargetScan软件预测miR-128-3p和Nrf2 mRNA上的结合位点，构建miR-128-3p结合位点的Nrf2野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告基因质粒，分别与miR-128-3p mimic或miR-NC共转染至293T细胞中。转染48 h后，根据双荧光素酶报告基因试剂盒说明进行测定，用萤火虫荧光素酶活性和肾荧光素酶活性比值表示荧光素酶的相对活性。

2 结果

2.1 抑制miR-128-3p表达对各组大鼠动脉PaO

、OI以及肺组织W/D值的影响

与sham组比较，Model组大鼠肺组织W/D值增加，PaO和OI值降低，差异有统计学意义(

P

<0.01)；与Model组比较，antagomir组大鼠肺组织W/D值降低，PaO和OI值增加，差异有统计学意义(

P

<0.01)，而NC组差异无统计学意义(

P

>0.05)；与antagomir组比较，antagomir+ML385组大鼠肺组织W/D值增加，而PaO和OI值降低，差异有统计学意义(

P

<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠动脉PaO2、OI以及肺组织W/D比较

2.2 抑制miR-128-3p表达对各组大鼠肺组织中miR-128-3p表达水平的影响

与sham组比较，Model组大鼠肺组织中miR-128-3p表达水平上升，差异有统计学意义(

P

<0.01)；与Model组比较，antagomir组大鼠肺组织中miR-128-3p表达水平降低，差异有统计学意义(

P

<0.01)，而NC组差异无统计学意义(

P

>0.05)；与antagomir组比较，antagomir+ML385组大鼠肺组织中miR-128-3p表达水平无统计学意义(

P

>0.05)。见图1。

图1 各组大鼠肺组织中miR-128-3p表达水平比较1：sham组; 2：Model组; 3：NC组; 4：antagomir组; 5：antagomir+ML385组；与sham组比较：**P<0.01；与Model组比较：##P<0.01

2.3 抑制miR-128-3p表达对各组大鼠BALF中相关因子含量的影响

与sham组比较，Model组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量上升，差异有统计学意义(

P

<0.01)；与Model组比较，antagomir组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量降低，差异有统计学意义(

P

<0.01)，而NC组差异无统计学意义(

P

>0.05)；与antagomir组比较，antagomir+ML385组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量上升，差异有统计学意义(

P

<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比较

2.4 抑制miR-128-3p表达对各组大鼠肺组织中氧化应激水平的影响

与sham组比较，Model组大鼠肺组织中MDA和ROS水平上升，SOD活性下降，差异有统计学意义(

P

<0.01)；与Model组比较，antagomir组大鼠肺组织中MDA和ROS水平下降，SOD活性上升，差异有统计学意义(

P

<0.01)，而NC组差异无统计学意义(

P

>0.05)；与antagomir组比较，antagomir+ML385组大鼠肺组织中MDA和ROS水平上升，SOD活性下降(

P

<0.01)，差异有统计学意义(

P

<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠肺组织中SOD、MDA和ROS水平比较

2.5 抑制miR-128-3p表达对各组大鼠肺组织病理学的影响

sham组大鼠肺组织结构完整，未见明显异常；Model组、NC组和antagomir+ML385组大鼠肺组织损伤严重，表现为间质水肿，肺泡萎陷、肺泡壁增大甚至出血，有肺透明膜形成；antagomir组大鼠肺组织结构相对完整，肺泡和间质肿胀程度明显减轻，较少炎症细胞出现，肺泡出血不明显。与sham组比较，Model组大鼠肺损伤评分增加，差异有统计学意义(

P

<0.01)；与Model组比较，antagomir组大鼠肺损伤评分降低，差异有统计学意义(

P

<0.01)，而NC组差异无统计学意义(

P

>0.05)；与antagomir组比较，antagomir+ML385组大鼠肺损伤评分增加，差异有统计学意义(

P

<0.01)。见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理学观察 HE×2001：sham组; 2：Model组; 3：NC组; 4：antagomir组; 5：antagomir+ML385组；与sham组比较：**P<0.01；与Model组比较：##P<0.01；与antagomir组比较：★★P<0.01

2.6 抑制miR-128-3p表达对各组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1表达水平的影响

与sham组比较，Model组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(

P

<0.01)；与Model组比较，antagomir组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(

P

<0.01)，而NC组差异无统计学意义(

P

>0.05)；与antagomir组比较，antagomir+ML385组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(

P

<0.01)。见图3。

图3 各组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达水平比较A：RT-PCR检测基因mRNA水平；B：Western blot检测基因蛋白表达水平； 1：sham组; 2：Model组; 3：NC组; 4：antagomir组; 5：antagomir+ML385组；与sham组比较：**P<0.01；与Model组比较：##P<0.01；与antagomir组比较：★★P<0.01

2.7 miR-128-3p与Nrf2的靶向作用关系

如图4A的miRNAs靶基因预测软件(TargetScan)分析结果显示，miR-128-3p在Nrf2基因3′-UTR区域存在靶向结合位点。如图4B的荧光素酶报告基因实验结果进一步证实，miR-128-3p显著降低野生型Nrf2荧光素酶活性(

P

<0.01)，而对突变型Nrf2荧光素酶活性无影响(

P

>0.05)。表明miR-128-3p与Nrf2确实存在靶向作用关系。

图4 miR-128-3p与Nrf2的靶向关系A：TargetScan预测miR-128-3p在Nrf2 3′-UTR区域的靶向结合位点；B：双荧光素酶实验证实miR-128-3p和Nrf2的结合关系;与NC组比较：**P<0.01

3 讨论

ARDS是威胁着人类健康的肺部急性炎症性综合征，目前无特异性和有效的治疗方法，miRNAs的发现，将成为ARDS潜在的诊断新指标和治疗新靶点。近些年来，不少学者用不同的ARDS动物模型筛选出了有表达差异的miRNAs，来探索miRNAs对ARDS的调控作用。Huang et al通过高潮气量机械通气法建立大鼠ARDS模型，发现miR-24和miR-26a等表达下调，而miR-128-3p、miR-127和miR-135b等表达显著上调，暗示它们在ARDS的发病过程中可能有重要的调节作用。miR-128-3p在多种组织中表达，但其功能研究相对较少，有研究报道miR-128-3p具有调控脂肪生成和脂肪分解、保护心肌细胞、保护神经、抑制炎症反应和抗肿瘤等多种生理作用，但miR-128-3p在ARDS中的作用及机制尚不明确。本研究通过构建肺损伤大鼠模型，经颈部气管注射miR-128-3p抑制剂来探讨miR-128-3p对大鼠肺组织的保护作用及可能作用机制，研究结果显示，miR-128-3p在模型大鼠肺组织中高表达，抑制miR-128-3p表达可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，增强机体抗氧化能力，从而改善模型大鼠肺损伤。

本研究通过尾静脉注射油酸(0.15 ml/kg)的方法建立肺损伤大鼠模型，结果显示，模型大鼠动脉OI<200 mmHg，同时肺W/D比值较Sham组升高，肺组织HE染色结果显示肺部结构明显损伤、肺泡腔萎陷、出血，肺泡壁明显增厚，有大量红细胞渗出，与前人研究结果一致，提示模型制备成功。进一步通过RT-PCR检测大鼠肺组织中miR-128-3p表达，发现模型大鼠肺组织中miR-128-3p表达水平明显升高，提示miR-128-3p在ARDS可能发挥着重要作用。为进一步验证其具体作用，本研究通过颈部气管注射的方式给模型大鼠注射miR-128-3p抑制剂miR-128-3p antagomir，结果显示模型大鼠肺组织miR-128-3p表达水平下调，同时肺组织病理性改变明显减轻，肺W/D比值降低，提示抑制miR-128-3p表达可缓解模型大鼠肺组织损伤。

ARDS的主要发病机制之一就是各种病因诱发的肺内或全身过度炎症反应，肺内炎症反应会造成内皮细胞和上皮细胞损伤，导致肺泡毛细血管通透性增高，从而使肺组织换气功能恶化引起低氧血症，导致严重肺水肿，引起蛋白渗出导致肺透明膜形成。TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞炎症因子整体水平变化而导致肺内皮、上皮屏障损伤是ARDS的主要特征之一，这些炎症因子可反映机体的免疫情况，作为反映肺组织损伤严重程度的指标。近年来研究发现，增强抗氧化能力，抑制氧化应激是干预ARDS的重要的策略之一。SOD、MDA和ROS是氧化应激损伤的标志物，其含量可反映机体清除氧自由基的能力。本研究对各组大鼠BALF中炎性因子含量以及肺组织中的氧化应激水平进行了检测，研究结果显示：与Sham组比较，Model组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量以及ROS和MDA水平增加，SOD活性下降，说明机体内的氧化与抗氧化平衡被打破，产生氧化应激损伤，与冯敏等研究结果一致。抑制miR-128-3p表达可显著降低BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，以及ROS和MDA水平，增加SOD活性，提示抑制miR-128-3p表达可通过降低肺部炎症反应，减轻机体氧化应激损伤来改善模型大鼠肺损伤。

Nrf2/HO-1信号通路是细胞内经典的抗氧化应激通路，其激活可降低氧化应激损害起到保护细胞的作用。进一步探究抑制miR-128-3p表达可增强肺损伤大鼠抗氧化能力的具体作用机制，本研究对各组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的表达水平进行了检测，研究结果显示：与Sham组比较，Model组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的表达水平降低，抑制miR-128-3p表达可增加Nrf2和HO-1在肺组织中的表达水平，进一步在抑制miR-128-3p表达的基础上对模型鼠腹腔注射Nrf2抑制剂ML385，发现Nrf2和HO-1的表达水平又随之下降。而通过生物信息预测发现，miR-128-3p基因序列上存在Nrf2的结合位点，进一步通过荧光素酶报告实验确定了miR-128-3p能靶向调控Nrf2的表达。说明抑制miR-128-3p表达确可通过促进模型大鼠肺组织中Nrf2/HO-1信号通路的激活，增强其抗氧化能力，从而减轻大鼠肺损伤。

综上所述，抑制miR-128-3p表达可显著减轻大鼠的肺损伤，其作用机制可能与通过靶向调控Nrf2表达，促进Nrf2/HO-1信号通路激活，抑制肺组织炎症反应有关，该研究结果可为ARDS临床治疗药物的研发提供实验依据。