荧光定量PCR检测巨细胞病毒DNA试剂盒的性能验证及评价

朱舜华，李世宝,2△

1.徐州医科大学医学技术学院，江苏徐州 221000；2.徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州 221000

巨细胞病毒(CMV)属于疱疹病毒亚科,在宿主体内具有很强的潜伏能力[1]。根据宿主感染的时间可以分为先天性感染和获得性感染[2]。先天性感染主要是孕妇通过垂直途径感染新生儿[3]，会引起新生儿小头畸形，脑室肿大，肝脾肿大等疾病[4]。成人感染CMV一般无症状，当机体免疫力低下时可导致肺孢子菌肺炎等并发症[5]。目前临床检测抗体的灵敏度与特异度低，实时荧光定量PCR因其在检测中快速、高效特点在临床被广泛应用[6]。根据CNAS-CL36医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明，实验室开展新项目前需对所采用的商业检测试剂进行方法学性能验证，主要包括精密度、检出限、正确度、线性范围等[7]。因此，本研究对上海之江生物的CMV核酸(CMV-DNA)试剂盒进行性能验证，以期达到临床检测的要求。

1 材料与方法

1.1标本来源 CMV-DNA标本来自2020年6月1日徐州医科大学附属医院感染科。

1.2仪器与试剂 SLAN-96P荧光定量PCR仪。CMV-DNA测定试剂盒(批号P20191201)、CMV-DNA阴性血清对照品和CMV-DNA临界阳性对照品均购自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取与PCR反应 严格按照CMV-DNA测定试剂盒的要求进行。37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min循环一次；然后93 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循环40次，单点荧光检测在60 ℃。PCR结果判读：仪器生成准曲线后，会自动显示定量值。当检测样本的检测值在[(1.00E+03)～(1.00E+07)]copy/mL范围时，测定结果有效。如果超过该范围可将其稀释后再进行测量。

1.3.2性能验证指标及验证方法

1.3.2.2检出限 根据EP17-A文件的要求进行检测线验证时，至少测量20次。因此将已知结果的CMV阳性标本，稀释至试剂检测下限(1.00E+03)copy/mL附近，对该标本重复测量20次，进行结果分析,可接受标准：阳性检出率>95%。

1.3.2.3正确度 取20例已知测定结果的样本，其测定浓度值范围为[0～(1.50E+07)]copy/mL，使其分布于整个线性范围内。测定结果与标准品结果进行比较，绘制曲线。

1.3.2.4线性范围 将7次方高浓度样本进行10倍梯度稀释达到或接近试剂盒标明的定量检测限，进行2次重复检测。然后以测量值为X，理论值为Y绘制拟合曲线，计算线性相关系数，R2≥0.980 0则符合要求。

2 结 果

2.1精密度 批内精密度验证结果：高浓度样本与低浓度样本20次检测结果其对数值的CV分别为1.64%、1.56%,见表1。批间精密度验证结果：高浓度与低浓度样本分别测定5次，每次重复4次其对数值的CV分别为1.64%、1.56%，见表2。批间与批内精密度CV值均小于规定标准5%，符合要求。

表1 CMV-DNA批内精密度评价结果

表2 CMV-DNA批间精密度评价结果

续表2 CMV-DNA批间精密度评价结果

2.2检出限 已知试剂盒的最低检出限为(1.00E+03)copy/mL，将样本稀释到检出限，重复测定20次，其阳性检出率为100%，超过行业标准规定的95%，符合要求，见表3。

表3 CMV-DNA检出限的评价结果

2.3正确度 测定值与理论值的线性拟合方程为Y=0.984 1X+0.058 6，其R2为0.998 7符合要求，见图1。

图1 正确度线性结果

2.4线性范围 将样品浓度稀释分布在试剂盒的线性范围内，绘制线性拟合方程为Y=1.004 9X+0.018 2，R2=0.999 9，见图2。

图2 梯度稀释线性结果

3 讨 论

目前，我国是CMV感染的高发区，人均感染率为85%左右[8]。在人体免疫功能正常时CMV处于潜伏期,当人体免疫功能缺陷时，潜伏的病毒会大量增殖，所以，CMV感染是艾滋病患者的第二大机会性感染[9]。CMV感染也是常见的先天性感染，新生儿的免疫系统尚未发育完全，感染CMV之后会产生严重的后果，如听力损伤、神经功能异常等[10]。因此，对CMV准确、快速地检测显得尤为重要。

实时荧光定量PCR对CMV检出率高，克服了传统PCR重复性差、易假阳性等缺点，在临床得到了广泛的应用[11]。实时荧光定量PCR通过检测CMV-DNA载量来实现早期检测，尤其是在CMV-IgM阴性时[12]。在进行实时荧光定量PCR结果分析时，需要将原始数据取对数再进行分析，因为实时荧光定量PCR原始数据成偏态分布，必须将其转化为正态分布才能进行分析[13]。实验室需对试剂进行独立验证，确保试剂盒在本实验符合规定的要求。精密度评价实验应放在其他实验之前，因为精密度表示测量结果的再现性，是获得良好准确性的先决条件[14]。本实验结果显示,高浓度与低浓度样本批内与批间精密度的CV均小于5%，符合要求。

正确度为检测结果均值与真值之间的一致程度，R2=0.998 7，说明测量值与理论值之间具有良好的一致程度，该试剂盒的正确度符合要求。将样本稀释在检出限(1.00E+03)copy/mL附近，重复测量20次，检出率为100%，这有利于提高临床诊断的精准。线性范围关系到是否可以为临床提供可靠的信息，线性范围越宽则就越适用于临床[15]。本实验所用试剂盒标明的线性范围为[(1.00E+03)～(1.00E+07)]copy/mL，但是本实验验证所用的线性范围为[(2.40E+03)～(2.26E+07)]copy/mL，最高浓度已经超过试剂盒所规定，线性良好R2=0.999 9，证明结果可靠。

综上所述，本实验的CMV-DNA试剂盒精密度高,正确度好,检出限可靠,具有良好的线性范围，可以满足临床的需要。