高盐诱导下以 TonEBP/NF-κB 通路为基础的小鼠巨噬细胞表型偏移机制的研究

朱 哲，杨国红，赵季红

长期过量的食盐摄入，不仅会增加患高血压的风险，还可对相关靶器官造成损害。多项研究表明，盐敏感性高血压等心血管疾病的发生、发展及其靶器官损害的病理过程与巨噬细胞表型偏移密切相关。基于当前对巨噬细胞的研究，通常将其分为M1型和M2型两种亚型。本课题组前期研究发现，高盐喂养下小鼠巨噬细胞表型向M1型偏移可加重机体炎性反应，升高血压并促进小鼠左心室重塑。在后续的细胞实验中本课题组发现高盐刺激下小鼠巨噬细胞向M1型发生偏移的同时伴随张力应答增强子结合蛋白(tonicity-responsiveelement binding protein，TonEBP)与核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表达增强，且二者表达水平呈正相关。TonEBP可在高渗条件下被激活，参与维持哺乳动物细胞内渗透压力的平衡。位于TonEBP下游的NF-κB是细胞内重要的核转录因子，广泛参与机体各类炎性反应。对于高盐刺激下巨噬细胞表型偏移是否和TonEBP/NF-κB信号通路激活有关，通过调节此通路是否可以干预巨噬细胞表型偏移方向的研究还未有报道。本研究通过探讨高盐刺激下巨噬细胞表型偏移的可能机制，为进一步研究巨噬细胞相关心血管疾病的防治提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料 Raw264.7细胞(小鼠巨噬细胞)由武警特色医学中心实验室提供。TonEBP基因沉默慢病毒载体设计构建与包装服务由上海合生基因生物公司提供；氯化钠购自天津风船化学试剂科技公司；胎牛血清(FBS)、高糖培养液(DMEM)购自美国Gibco公司;引物设计合成由北京六合华大基因科技有限公司提供；RIPA组织/细胞快速裂解液(RIPA buffer high)、嘌呤霉素(Puromycin)、Tween 20均购自北京索莱宝科技公司；GAPDH抗体、p-IKKα/β抗体、p-NF-κB抗体购自美国Affinity公司；SYBRGreen实时定量PCR试剂、5X All-IN-One RT MasterMix、NF-κB 抗体、TonEBP抗体购自美国Abcam公司；BCA 法蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天公司。

1.2方法

1.2.1 细胞培养 将细胞置于10%FBS的高糖培养液中，37℃培养于5%CO2无菌条件下，待细胞长至对数生长期，选取合适量的细胞进行实验。

1.2.2 慢病毒感染和筛选 针对小鼠TonEBP基因设计3种针对不同干扰位点的绿色荧光慢病毒干扰载体和1种绿色荧光慢病毒空载载体pHS-ASR-LW198，载体信息见表1。将Raw264.7细胞以5×105/孔接种于24孔板，待细胞融合至约50%密度大更换培养液，依据每种慢病毒滴度及预先确定的MOI值，加入适量慢病毒后继续培养(空白对照组细胞不加入慢病毒)。后以嘌呤霉素筛选培养液连续筛选至空白对照组细胞90%以上死亡后，停止筛选，获得三组稳定干扰TonEBP的慢病毒感染细胞及一组阴性对照慢病毒空载细胞。之后将各组细胞扩大培养，稳定传代。传代3次后，提取各组细胞RNA，利用Real-time PCR检测各组细胞TonEBP 基因相对表达量，选取干扰效率最高的慢病毒感染细胞株命名为TonEBP-shRNA，野生型Raw264.7细胞株命名为Control。

表1 shRNA慢病毒靶序列

1.2.3 实验分组及干预方式 为检测高盐刺激下TonEBP/NF-κB对巨噬细胞表型的调控作用，设置分组，分为对照(Control)组，高盐(HS，40 mmol/L Nacl)组，高盐+TonEBP-shRNA(HS+TonEBP-shRNA)组，高盐+吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC, pyrrolidinedithioearbamate，NF-κB抑制剂，HS+PDTC)组。分别将各组细胞以合适数量接种于6孔板中，待细胞贴壁后，弃去HS组、HS+TonEBP-shRNA组和HS+PDTC组培养液，给予高盐培养液进行干预。HS+PDTC组在给予高盐培养液干预前2 h加入配置好的PDTC溶液，2 h后与HS组、HS+TonEBP-shRNA组同步更换高盐培养液。高盐干预24 h后收集各组细胞进行相关实验。

1.2.4 Real-time PCR检测各组M1、M2型巨噬细胞表型标志物基因表达情况 分组培养24 h后取各组细胞1×106个，分别接种于10 cm培养皿中。培养24 h后收取各组细胞，利用Trizol法提取各组细胞RNA，测定各组RNA的纯度及浓度后进行反转录，合成cDNA，以合适倍数稀释cDNA后采用Real-time PCR法检测mRNA的表达量。设置复孔，以GAPDH为内参，目的基因相对表达量由2-ΔΔCt计算得出(ΔΔCt=实验组ΔCt-内参组ΔCt)。

1.2.5 Western blot法检测各组TonEBP、pIKKα/β、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达水平 取各组对数生长期细胞2×106个，离心后留取沉淀。加入配制好的细胞裂解液吹打混匀后于冰上裂解30 min，离心后收集蛋白上清液。配制标准BCA液，按其浓度梯度，每孔加入BCA液100 μl，5 μl蛋白上清液。避光孵育30 min后上机检测蛋白浓度。以Loading Buffer稀释蛋白上清液，之后于100℃恒温器中煮沸7 min，完成蛋白变性。取蛋白样本于SDS-PAGE分离等量蛋白后进行转膜。转膜结束后将PVDF膜放入TBST中清洗5 min后以5%BSA溶液于摇床上室温封闭1 h。洗膜3次，添加一抗，4℃孵育过夜。洗膜3次，加入二抗工作液，室温条件下孵育1 h,洗膜后置于凝胶成像仪中进行显影，观察各组蛋白表达情况。

2 结 果

2.1 稳定干扰TonEBP细胞株的建立 利用慢病毒成功感染细胞后经筛选得到4组稳定株。测定各组稳定细胞株中TonEBP mRNA相对表达量，结果与对照组细胞相比，编号pHS-ASR-LW222的病毒株干扰效率达70%以上，差异有统计学意义(P<0.01)，明显高于其他组，而空载慢病毒感染组干扰效率与对照组相比，差异无统计学意义(图1)。

图1 Real-time PCR检测各组细胞TonEBP mRNA表达水平

2.2 高盐刺激下各组M1、M2型巨噬细胞表型标志物基因mRAN表达情况 本部分实验为验证高盐刺激下巨噬细胞TonEBP/NF-κB通路的激活可影响其表型偏移方向，我们检测了各组细胞TonEBP、NF-κB、M1型巨噬细胞表型标志物TNF-α、CCL5、INOS和M2型巨噬细胞表型标志物MRC-1、FIZZ1、IL-10的mRNA相对表达量。结果显示：(1)较Control组，HS组TonEBP、NF-κB和M1型巨噬细胞表型标志物的mRNA水平均明显升高(P<0.05)，M2型巨噬细胞表型标志物的mRNA水平均明显降低(P<0.05);(2)与HS组比较，HS+ TonEBP-shRNA组、HS+PDTC组的TonEBP、NF-KB表达水平均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，M1型巨噬细胞表型标志物mRNA表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，M2型巨噬细胞表型标志物mRNA水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示高盐刺激可促使小鼠巨噬细胞向M1型方向偏移，通过干扰TonEBP和NF-κB的表达可使巨噬细胞向M2型方向偏移，M1型巨噬细胞比例减少(表2)。

表2 各组细胞 TonEBP、NF-κB及表型标志物mRNA水平

2.3 各组TonEBP、p-IKKα/β、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达水平 Western blot结果显示：(1)HS组TonEBP、NF-κB、p-NF-κB、p-IKKα/β及NF-κB磷酸化比例较Control组明显增加(P<0.05)；(2)与HS组比较，HS+TonEBP-shRNA组TonEBP蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，HS+PDTC组TonEBP蛋白表达水平略有增加，但差异无统计学意义；HS+TonEBP-shRNA组和HS+PDTC组的NF-κB、p-IKKα/β、p-NF-κB蛋白表达水平均明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，NF-κB磷酸化比例略有下降，但差异无统计学意义。Western blot对蛋白的检测结果与mRNA的变化趋势基本一致，提示高盐刺激下TonEBP/NF-κB通路被激活，通过下调TonEBP的表达可有效抑制NF-κB的活化(图2、表3 )。

图2 Westem blot检测TonEBP-NF-κB信号转导通路在高盐干预下的蛋白表达情况

表3 各组细胞相关蛋白表达水平

3 讨 论

目前，心血管疾病已成为世界最重要的公共卫生问题之一，最新数据表明，它是导致死亡和生活质量下降的主要原因[1]。有学者认为，长期高钠饮食下机体组织钠浓度超过限度会引起机体一系列炎性反应，激活机体免疫系统，最终导致以免疫系统失衡为特征的炎性状态，这也是高血压等心血管疾病的患病率近年显著上升的一个重要原因[2]。巨噬细胞作为免疫系统的主要功能细胞，其亚型比例失衡被证明与动脉粥样硬化、盐敏感性高血压等心血管疾病的发病及其靶器官损害密切相关[3]。研究表明，M1型巨噬细胞可以产生大量的促炎因子诱导炎性发生引发组织损伤，因此也被称为"促炎型"巨噬细胞。M2型巨噬细胞则可以抑制炎性反应，修复组织损伤，因此也被称为“抗炎型”巨噬细胞[4,5]。多项体内外实验发现，高盐刺激可促使巨噬细胞向M1型发生偏移，同时抑制M2型巨噬细胞的活化[6,7]。研究显示在伴随高血压发生的心、脑、肾等相关靶器官的损害过程中可见巨噬细胞在组织器官中大量浸润，且靶器官功能恶化程度与巨噬细胞亚型比例及浸润程度密切相关[8]。本课题组前期研究发现，高盐喂养下小鼠体内M1型巨噬细胞比例增加，M2型巨噬细胞比例下降，这一改变可加重小鼠体内的炎性反应、血压升高并促进左心室重塑的进程。

有研究表明，在正常组织中，信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)参与M1/ M2型巨噬细胞的比例的调节，由STATs介导的巨噬细胞表型偏移过程与IL-4、IL-13、IL-10及NF-κB等炎性因子的激活或抑制密切相关[9]，提示我们适当的炎性刺激或是巨噬细胞表型偏移的重要推力。然而当前有关高盐刺激下巨噬细胞表型偏移机制的研究却少有报道。本课题组前期细胞实验发现，高盐刺激下小鼠巨噬细胞中TonEBP 和NF-κB的表达明显升高，且两者表达量呈正相关(数据未发表)。TonEBP是细胞内广泛表达的转录因子，其不仅具有高渗环境下维持细胞稳态的功能，还可在一些炎性反应中发挥作用。多项研究表明TonEBP、NF-κB在巨噬细胞的极化过程中发挥十分重要的作用[10,11]，由此我们推测，高盐刺激下TonEBP/NF-κB通路的激活是导致巨噬细胞表型偏移的机制之一。

本研究以小鼠巨噬细胞为研究对象，通过慢病毒感染技术敲低细胞TonEBP的表达，留取TonEBP-shRNA稳定干扰细胞株。经测定后筛选，慢病毒感染细胞TonEBP mRNA的干扰效率达70%以上，说明感染成功可用作后续实验。因巨噬细胞活化后可释放大量炎性因子，如M1型巨噬细胞可释放促炎型细胞因子TNF-α、iNOS、CCL5等，M2型巨噬细胞可释放抗炎型细胞因子IL-10、MRC1、FIZZ1等[12,13]，所以我们选定以上因子分别作为M1、M2型巨噬细胞的表型标志物，检测各实验组以上基因及TonEBP、NF-κB的mRNA相对表达量通过与对照组比较来判定Raw264.7细胞偏移方向。结果显示单纯高盐刺激下TonEBP/NF-κB信号通路被激活，此条通路激活后可诱导小鼠巨噬细胞向M1型极化。进一步干扰TonEBP/NF-κB信号通路可一定程度上改变高盐刺激下巨噬细胞表型偏移方向。

为了进一步证实高盐刺激对TonEBP/NF-κB信号通路的激活作用，我们检测了此信号通路上相关蛋白表达水平。在大多数细胞中，NF-κB存在于胞浆中，与抑制性蛋白IK-β结合时处于无活性状态，在受到有效刺激后IK-β激酶IKK被激活发生磷酸化，构象发生改变，NF-κB脱落活化为p-NF-κB进入胞核参与有关基因的转录[14]。因此我们选定TonEBP、p-IKKα/β、NF-κB、p-NF-κB作为目标蛋白，采用Western blot法测定各组蛋白表达水平及p-NF-κB/ NF-κB比值，进一步评估高盐干预下TonEBP/NF-κB信号通路的激活情况。结果提示高盐刺激下TonEBP/NF-κB信号通路被激活，通过下调TonEBP的表达可有效抑制NF-κB的活化。有学者研究发现，在小鼠巨噬细胞中，TonEBP可通过增强NF-κB的活性来保护细胞免受高盐刺激的影响[15]，说明由高盐造成的高渗环境对NF-κB活性的刺激作用一定程度上取决于TonEBP活性。且有多项研究表明，NF-κB的活化是促使巨噬细胞向M1型发生极化的重要因素[16,17]。结合本研究及以上研究成果，进一步佐证了高盐刺激下巨噬细胞中TonEBP /NF-κB信号通路的激活是促使其向M1型巨噬细胞发生偏移的重要机制。

本研究结果表明，高盐刺激下TonEBP/NF-κB信号通路的激活是巨噬细胞向M1型方向偏移的可能机制，这一发现为高盐刺激下相关心血管疾病的发病机制提供了实验依据。然而包括盐敏感性高血压在内的相关心血管疾病的发病及发展是涉及全身多个系统的慢性炎性过程，体外实验或不能全面说明问题，还需要在体实验的支持和佐证。同时，不同亚型巨噬细胞功能特性、其局部浸润程度及分泌的细胞因子或是影响机体血压及靶器官损害程度的重要因素，有待进一步研究。