VEGF与Survivin反义寡核苷酸对裸鼠荷舌癌肿瘤的作用*

李腾宇 于肖鹏 李晓光 王延秀 李俊福 陈岱韻 孙 振

1.泰安市中心医院口腔科，山东 泰安 271000；2.泰安市中心医院疼痛科，山东 泰安 271000；3.山东第一医科大学第二附属医院口腔科，山东 泰安 271000

舌癌是一种发病率、复发率高的恶性肿瘤，发生复发后则预后不良。因此研究更加安全有效的治疗方法，例如基因治疗，就成为近来研究的热点。VEGF在舌癌等多种肿瘤中表达［1-4］，在肿瘤的血管生成中起重要作用，目前针对VEGF靶点的重组人源单克隆抗体-贝伐单抗，已经应用于临床。生存素（Survivin）是至今发现最强的凋亡抑制因子，与肿瘤增殖、转移等紧密相关，其可直接抑制Caspase-3及Caspase-7［5］，同时，Survivin也可对抗G2／M期对细胞凋亡的诱导，使肿瘤细胞可通过凋亡的关卡，增进癌细胞的异常增殖及生长［6］。在肺癌、卵巢癌等［7-8］研究中已证实，Survivin-ASODN可以明显抑制肿瘤生长。本研究将VEGF-ASODN、Survivin-ASODN联合应用，观察其对裸鼠舌癌移植瘤的治疗作用。

1 实验材料和方法

1.1 实验用动物

BALB／c，4～6周龄的雌性nu／nu裸鼠，体重20～22 g，共25只，购于斯莱克上海实验动物公司，SPF级的无菌饲养室内饲养。共5组，每组裸鼠5只。

1.2 实验试剂

VEGF反义寡核苷酸序列为：5＇-TGGCTTGAAGATGTACTCGAT-3＇，Survivin反义寡核苷酸序列为：5’-CCACGGCCTCCCAAAGTGCTG-3’，均用硫代磷酸化进行修饰，委托大连宝生物公司进行合成。Invitrogen公司提供阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000（LIP），免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物公司）。

1.3 实验方法

建立裸鼠移植瘤模型方法：无菌条件下Tca8113舌癌细胞制备成为单细胞悬液，浓度是1×107个细胞／ml，每只裸鼠右股部皮下注射0.2 ml，成瘤标准是皮下肿物直径超过0.5 cm。①联合ASODN组：每次在裸鼠瘤体及瘤周注入Survivin-ASODN、VEGF-ASODN各66μg，注射液体积为200μl，内含LipofectamineTM 2000和无血清1640液。②VEGF-ASODN组：同上述方法注射VEGFASODN 66μg。③Survivin-ASODN组：同法注射Survivin-ASODN 66μg。④脂质体组：同法注射等量脂质体200μl。⑤生理盐水（NS）组：注射等量NS200μl。3天注射1次，共7次。实验结束2 d后，全麻下处死裸鼠，称取肿瘤重量并测量大小，体积＝1／6πab2（a为肿瘤最大处长径，b为肿瘤最短径）。抑瘤率＝（NS组肿瘤重量－治疗组肿瘤重量）／NS组肿瘤重量×100%。肿瘤制作石蜡切片，免疫组织化学方法检测VEGF、Survivin、PCNA、CD34表达水平。

1.4 实验结果的判定方法

1.4.1 细胞质或细胞核有棕黄色颗粒为VEGF、Survivin蛋白表达阳性，见图1、图2。染色结果定量分析，使用HPIAS-1000彩色病理图文计算机分析系统。每张组织切片选取无非特异性染色、细胞棕黄色阳性颗粒清晰、能反映该片染色强度部位，选取4个视野，200倍镜头下检测组织切片光密度值（OD值），取其平均值，以此结果间接反映该片VEGF、Survivin的表达量。

图1 VEGF阳性Tca8113舌癌细胞浆内含有棕褐色颗粒（免疫组化DAB染色×400）

图2 Survivin阳性Tca8113舌癌细胞浆内含有棕褐色颗粒（免疫组化DAB染色×400）

1.4.2 分裂细胞核抗原（proliferating cell nuclear antige，PCNA）标记指数（PCNA label index，PLI）以细胞核出现棕褐色颗粒为PCNA阳性细胞，见图3。选取500个癌细胞，计数其中PCNA阳性细胞数量，其所占的百分比即为PLI。

图3 PCNA阳性Tca8113舌癌细胞核内含有棕褐色颗粒（免疫组化DAB染色×400）

1.4.3 肿瘤微血管计数的计算方法 依照Weidner［9］的评判标准，观察肿瘤组织内有染色的微小血管及毛细血管，血管有单个或多个内皮细胞出现棕色染色，即算作一个血管计数值，每张组织切片选取三个血管最多的肿瘤间质区，200倍镜头下进行血管计数，每个肿瘤标本分别计数五个视野，其均值即为肿瘤的微血管密度（microvessel density，MVD）。见图4。

图4 CD34阳性血管内皮细胞染色呈棕色（免疫组化DAB染色×400）

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 肿瘤组织中VEGF、Survivin表达的检测结果

取VEGF、Survivin免疫组织化学染色切片，在光学显微镜下观察，联合转染组、单独转染组与NS组、脂质体组相比，其肿瘤细胞染色较浅，阳性细胞数量减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）。联合转染组与VEGF-ASODN单独转染组比较，VEGF表达明显降低（P＜0.05），Survivin表达也明显降低（P＜0.05）。联合转染组与Survivin-ASODN单独转染组比较，VEGF表达明显降低（P＜0.01），Survivin表达也明显降低（P＜0.05）。差异均有统计学意义。NS组和脂质体组比较差异未见统计学意义（P＞0.05），见表1。说明VEGF-ASODN及Survivin-ASODN对肿瘤VEGF及Survivin表达有明显的抑制作用，联合转染抑制作用更强。

2.2 PLI检测结果

在联合转染组和单独转染组，PLI明显低于NS组及脂质体组，联合转染组较单独转染组PLI明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），NS组与脂质体组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。说明VEGF-ASODN及Survivin-ASODN对肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用，联合转染抑制作用更强，NS及脂质体无明显抑制肿瘤增殖作用。

2.3 肿瘤组织的MVD检测结果

CD34表达阳性的血管内皮细胞胞浆内有棕褐色染色，联合转染组及单独转染组CD34的表达明显低于NS组及脂质体组，联合转染组较单独转染组CD34的表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），NS组与脂质体组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。说明VEGF-ASODN及Survivin-ASODN明显抑制肿瘤的血管内皮细胞生长增殖，联合转染的抑制增殖生长作用更强。

表1 各实验组肿瘤组织VEGF、Survivin和PLI、MVD检验结果（±s，n＝5）

表1 各实验组肿瘤组织VEGF、Survivin和PLI、MVD检验结果（±s，n＝5）

注：与NS组比较，*P＜0.01。与脂质体组比较，ΔP＜0.01。与VEGF-ASODN组比较，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05。与Survivin-ASODN组比较，☆P＜0.01，☆☆P＜0.05。

组别 VEGF（OD值） Survivin（OD值）PLI MVD NS组0.59±0.03 0.62±0.03 38.03±3.67 17.37±1.14脂质体组 0.57±0.04 0.60±0.03 36.17±2.21 16.72±2.15 VEGF-ASODN组 0.38±0.03*，Δ 0.41±0.02*，Δ 20.18±2.18*，Δ 10.03±1.38*，Δ Survivin-ASODN组 0.41±0.04*，Δ 0.36±0.02*，Δ，▲▲ 19.27±2.17*，Δ 10.12±1.29*，Δ联合ASODN组 0.33±0.02*，Δ，▲▲，☆☆ 0.31±0.03*，Δ，▲，☆☆ 10.16±1.36*，Δ，▲，☆ 7.01±1.18*，Δ，▲▲，☆☆Welch F值 63.33 143.21 120.21 47.73 P值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 移植瘤的重量、体积和抑瘤率检测结果

联合转染组和单独转染组与NS组及脂质体组比较，其体积、重量明显减小，差异均有统计学意义（P＜0.01）。联合转染组与单独转染组比较，其体积、重量更小，差异有统计学意义（P＜0.01）。联合转染组和单独转染组与脂质体组比较，其抑瘤率差异有统计学意义（P＜0.01）。联合转染组与单独转染组比较，其抑瘤率差异亦有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 移植瘤的平均体积及重量（±s，n＝5）

表2 移植瘤的平均体积及重量（±s，n＝5）

注：与NS组比较，*P＜0.01。与脂质体组比较，ΔP＜0.01。与VEGF-ASODN组比较，▲P＜0.01。与Survivin-ASODN组比较，☆P＜0.01。

组别 肿瘤平均体积（cm3） 肿瘤平均瘤重（g） 抑瘤率（%）NS组 2.52±0.38 2.27±0.34—脂质体组 2.21±0.32 1.99±0.23 12.33±4.07 VEGF-ASODN组 1.21±0.11*，Δ 1.09±0.12*，Δ 51.98±9.36*，Δ Survivin-ASODN组 1.24±0.12*，Δ 1.12±0.14*，Δ 50.66±9.27*，Δ联合ASODN组 0.61±0.13*，Δ，▲，☆ 0.55±0.13*，Δ，▲，☆ 75.77±9.04*，Δ，▲，☆Welch F值 53.33 57.03 50.67 P值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨 论

肿瘤的发生及发展调控复杂，是多途径、多因子及多通路的作用结果，所以单靶点治疗难以根治肿瘤［10］。因此我们考虑同时多靶点干预，探讨其作用效果。目前抗血管生成是研究热点之一［11］，VEGF是其经典靶点，已有实验证明其安全有效［12］。我们的前期研究表明，单VEGF-ASODN对癌细胞增殖抑制明显［13-14］。Survivin表达于多数肿瘤组织，而且正常组织几乎不表达，这种表达的特异性使其成为理想的靶点。本实验将VEGF-ASODN、Survivin-ASODN联合应用，进行双靶点基因治疗，观察该方法对肿瘤生长的影响。本实验结果证实了VEGFASODN及Survivin-ASODN联合应用的效果更佳。单独使用VEGF-ASODN或Survivin-ASODN均有效地抑制了肿瘤生长。但与单独应用相比，联合转染组表现出了比单ASODN更强的抑制肿瘤生长的作用效果，差异具有统计学意义（P＜0.01）。这可能与VEGF、Survivin表达具有相关性，和两者对肿瘤的作用途径有关联［15-18］。在ASODN单独转染组，其本身的靶基因表达出现了降低，同时另一基因也表达降低（P＜0.01）。这样联合转染组既有两者对本身靶基因的表达抑制，又有对应基因的抑制作用，两个作用叠加互相强化，使得联合转染组VEGF和Survivin表达较单独转染组更低（P＜0.01）。说明VEGF和Survivin表达可能信号通路相关，且有相互促进作用。由此推断VEGF-ASODN既抑制了VEGF表达，同时可能降低了Survivin抗凋亡作用，促进肿瘤血管退化，Survivin-ASODN除了抑制Survivin表达，同时可能抑制VEGF基因表达，加速肿瘤血管凋亡，此结果与其他作者的［19-20］研究基本相同。

PCNA为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，常常作为评价细胞增殖状态的指标。在细胞增殖周期中，G2／M期是一重要调控检查点，肿瘤细胞在DNA损伤后，有选择性地停留在G2期的趋势，所以在G2／M期，通过诱导凋亡可以消除异常细胞［21］，例如肿瘤细胞。而Survivin-ASODN可以阻滞瘤细胞停留在G2／M期，进而有利于促进诱导细胞凋亡［8，22］。联合转染组不但增加了诱导凋亡，同时减少血管生长，本实验的移植瘤PCNA表达显著降低（P＜0.01），说明明显降低了舌癌细胞增殖。MVD反映肿瘤的血管密度和营养供给情况，本实验单独转染组明显降低MVD和移植瘤体积及重量（P＜0.01），联合转染组作用更强（P＜0.01），说明其明显抑制了肿瘤微血管生长和肿瘤生长。本实验结果表明，VEGF和Survivin双靶点ASODN联合应用治疗舌癌，效果优于单靶点。通过ASODN抑制Survivin及VEGF的表达，进而降低舌癌细胞增殖生长，同时减少舌癌新生血管生成，可以达到治疗舌癌的目的。这为舌癌的综合治疗提供了一个新手段，应用前景广阔。