自拟补气活血方治疗气虚血瘀模型大鼠的血液学评价*

许家伟

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。心脑血管疾病给家庭和社会带来沉重的经济负担，气虚血瘀证作为老年心血管疾病的多发证型，尤其不能被忽视［1］。“药食同源”是古人在食物和药物的发现中总结的智慧［2］。补气活血方作为药食同源类药方，是由诸多具有补气、补血、活血化瘀等功效的药物相互配伍组成的，用以补中益气、活血生津、通经活络，其药效功能对气虚血瘀证有着良好的作用［3-4］。本研究旨在研究自拟补气活血方在不同剂量下对气虚血瘀证大鼠的血液学评价。

1.2 材料、试剂及仪器 DMEM/F12培养基购自Gibco公司；RMPI-1640购自Gbico公司；LipofectamineTM 2000 购自Invitrogen公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司；抗LDH抗体购自Abcam公司；抗GAPDH抗体购自CST公司；GV219-PTEN(PTEN-OE)及对照质粒(NC)由吉凯生物技术公司构建；LDH、LD试剂盒购自南京建成生物工程研究所；人子宫内膜癌细胞株HEC-1-A及实验仪器由上海交通大学第一人民医院妇产科实验室提供。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠180只，雌雄各半，体重180～220 g，由本溪长生生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（辽）2015-0001。于辽宁中医药大学动物房饲养，动物使用许可证号SYXK（辽）2013-0009。

2014年5月，为认真贯彻落实党的十八大和十八届三中全会精神，加强基层服务型党组织建设，中共中央办公厅印发了《关于加强基层服务型党组织建设的意见》，这是对基层党组织功能定位的深化，是基层党组织建设工作思路创新和方式方法转型的必由之路，具有十分重要的意义〔1〕。

1.2 药材制备

补气活血方（人参10 g，甘草10 g，淮小麦20 g，大枣10 g，姜黄10 g，当归10 g，山药15 g，炒山楂15g），补阳还五汤（黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，红花3 g，川芎3 g，地龙3 g）。分别将补气活血方与补阳还五汤中各味药混合后在水中浸泡1h，后加至10倍量水煎煮1 h，滤去煎煮液备用。再添入8倍量水，煎煮1 h后收集煎煮液，与第一次煎煮液合并浓缩［5］，制备出高剂量补气活血方1.25 g／ml与阳性对照药补阳还五汤1.45 g／ml，高剂量稀释后可得到0.625 g／ml、0.3125 g／ml中低剂量药物。

1.3 试剂

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料采用（±s）表示，各组间的比较采用单因素方差分析ANOVA的LSD-t检验分析，P≤0.05则认为差异有统计学意义。

1.4 仪器

1.5.3 血液流变学测定

1.5 方法

1.5.1 气虚血瘀模型的制备及给药

将雌雄各半的大鼠随机分为6组，空白组、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。每组30只，除空白组外，均采用饥饿、劳累、寒冷相结合的方式复制气虚血瘀模型。造模前，适应性饲养一周。造模时，除空白组正常饮食饮水外，其余各组每天限制以40 g／kg给予饲料［6］，并将大鼠放入水温14～16℃，水深（35±5）cm，直径为50 cm的水桶中进行游泳，以每组大鼠自然沉降没入水中不能自主上浮为其疲惫标准，当全组有50%出现自然沉降时，全组停止游泳捞出，使之暴露于空气中自然晾干［7］，不予擦拭。给药组每天按照10 ml／kg标准灌胃，空白组给予等量的生理盐水，连续灌胃60天，取血前一天禁食24 h，不禁水。

在车牌定位时，当遇到整张图片较为昏暗或者转化为灰度图像后区分度不高等情况时，使用OTSU算法，就会出现二值化后车牌区域值为0，即为黑色，导致车牌定位失败。此外，由于车牌定位主要基于数学形态学运算，运用腐蚀膨胀操作，如果图片中也有二值化后白色像素点比较密集的地方，可能会被误判为车牌区域。

全血黏度：60天模型组相对于空白组提升明显，阳性对照组与中高剂量组相对模型组下降明显，低剂量组相对模型组有下降趋势。血浆黏度：60天模型组相对空白组有明显提升，高、中、低剂量组相对模型组明显下降。见表1。

腹主动脉采血于肝素钠和柠檬酸钠采血管内。取60天大鼠心脏用10%氯化钾溶液冲洗，使其充分舒张。切取心肌组织，用4%多聚甲醛溶液固定［8］。

半自动血液流变仪LBY-N6K，（北京普利生仪器有限公司）；Sysmex CA510型全自动血凝分析仪（日本Sysmex株式会社）；酶标仪（美国伯乐Bio-Rad公司）。

将1.5.2中肝素钠采血管轻轻上下震荡，使血液产生抗凝作用，用血液流变仪测定全血黏度和血浆黏度。

1.5.4 凝血四项测定

HE染色结果显示，空白组心肌组织为正常心肌组织，心肌细胞横纹清晰，细胞结构完整，间质内未见血管扩张及炎性细胞的浸润。而在模型组中，可见心肌结构破坏、紊乱、纤维增生。低剂量组心肌细胞损伤程度较模型组明显减轻，细胞结构大体规整，可见少量的纤维化改变，但无明显大片纤维化病灶形成。中高剂量组心肌细胞纤维化程度进一步减轻，未见明显纤维化改变。见图1。

1.5.5 PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶、F1＋2片段含量测定

将1.5.4中血浆按照ELISA试剂盒步骤操作，并用酶标仪测定吸光度，绘制标准曲线，计算待测物质浓度。

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1.5.6 统计学方法

PT测定试剂盒（批号：1905048）、FIB测定试剂盒（批号：1905010）、TT测定试剂盒（批号：1905079）、APTT测定试剂盒（批号：1905026）、氯化钙、希森美康清洗液购于上海长岛生物技术有限公司。凝血片段F1＋2测定试剂盒、谷氨酸羧化酶测定试剂盒、PIVKA-Ⅱ测定试剂盒购于上海酶联生物科 技 有 限 公 司（批 号：ml204917、ml059265、ml601445）。

2 结 果

2.1 心脏病理形态变化

将1.5.2中柠檬酸钠采血管轻轻上下震荡，使血液产生抗凝作用，冷冻离心15 min使血浆分离出，使用全自动血凝分析仪分析，剩余血浆吸入EP管内，－80℃保存。

图1 各组大鼠心肌组织病理学变化（HE染色，×400）

2.2 血液流变学变化

1.5.2 标本采集

表1 60天大鼠血液流变学指标（±s，n＝10）

表1 60天大鼠血液流变学指标（±s，n＝10）

注：与空白组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 全血黏度／（mpa／s）3-1 60-1 200-1 血浆黏度150-1／（mpa／s ）空白组18.80±2.76 5.86±0.81 4.35±0.77 1.46±0.08模型组 14.32±1.04＃＃ 4.71±0.93＃＃ 3.23±0.47＃＃ 1.13±0.14＃＃阳性对照组 16.19±1.20** 5.61±0.72* 3.84±0.37** 1.23±0.05*低剂量组 15.13±1.27 5.03±0.51 3.67±0.41* 1.21±0.06*中剂量组 16.04±1.71* 5.53±0.67* 3.73±0.27** 1.28±0.02**高剂量组 16.36±1.67** 5.66±0.43** 3.96±0.25** 1.31±0.11**

2.3 大鼠凝血四项指标观察

气虚血瘀证动物模型是中医理论中一种常见的证候模型。“气为血之帅”，气能行血，气虚不能充分推动血液运行以致血行不畅而瘀滞，或气不行津，导致痰饮水湿停聚，而间接产生血流受阻致瘀，则发展为气血同病、气虚血瘀（因虚致瘀）。“血为气之母”，血能生气，血瘀则脏腑失养、生气乏源，亦能致使气虚，表现为气血同病、气虚血瘀（因瘀致虚）［9］。所以造模时从上述两个方向入手，“饥则损气”“劳则耗气”可通过劳累加饥饿的方式以达到因虚致瘀［10］，再通过寒凉的方式来达到因瘀致虚，多因素共同影响来营造气虚血瘀模型。

表2 60天大鼠凝血四项指标变化情况

2.4 大鼠血浆中PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶、F1＋2片段含量测定

大鼠血浆中PIVKA-Ⅱ：模型组含量相对空白组明显升高，药物组含量在60天相对于模型组明显降低；谷氨酸羧化酶：模型组含量相对于空白组明显下降，药物组含量相对模型组明显提升；F1＋2片段：模型组相较于空白组含量在20天明显上升，在40天和60天含量明显下降；药物组在40天和60天相较于模型组均明显上调。见表3～5。

表3 大鼠血浆中PIVKA-Ⅱ含量

表4 大鼠中血浆谷氨酸羧化酶含量

表5 大鼠血浆中中F1＋2片段含量

3 讨 论

60天模型组相较于空白组PT与APTT上升明显，FIB在40天后明显下降，TT有上升趋势。药物组在60天均对PT和APTT有明显下调作用，中高剂量组FIB上调明显，TT相较模型组有回落趋势，见表2。

将冷冻的胰脏置于4℃冰箱中解冻，待样品将要完全解冻时从头、体、尾三个部位剪取约0.5 g左右的胰腺，并用分析天平准确称重。按质量体积比1∶9的比例加入匀浆介质在玻璃匀浆器中匀浆(整个操作过程都在冰浴条件下进行)。充分匀浆后将匀浆液倒入离心管中3 000 r/min 4℃条件下离心10 min，收集上清并迅速将上清液分装成若干份贮存于-20℃中，以备进行酶活性分析。

血液流变学是判断血液黏稠度的重要指标。本实验全血及血浆黏度明显下降，APTT和PT明显上升，FIB明显降低等数据表明，气虚血瘀模型大鼠处于低凝低黏的状态，为陈可冀［11］血瘀证分类中的血瘀证Ⅱ型，与李雅君［12］庞树龄等结果一致。部分疾病属于这一类型，主要表现为血液黏度低、血浆蛋白等有形成分不足，或者某一凝血功能不足等，常见贫血症、部分月经病、肝硬化等。

凝血四项是临床上血栓性疾病的常用检查指标之一，是反映机体凝血功能正常与否，从而判断是否有血液疾病及肝病的严重程度的重要手段［13］。在凝血四项结果中模型组PT在20天前有明显下降，在40天、60天时明显上升，FIB一直呈上升趋势，这种PT与APTT异常转换可能是其他因素影响下的结果。肝脏作为机体的主要产热单位，在机体遇到寒冷时会主动进入应激状态，不断产生热量，长久以来会造成损伤，进入失代偿期。并且饥饿情况下肝部代谢功能降低，缺乏对维生素K的吸收与补充，导致凝血功能异常，通过APTT升高和PT升高推断是维生素K缺乏导致，并且APTT和PT在20天时的表现与40天和60天相反，FIB表现降低预测模型大鼠有DIC前期高凝期和中期消耗性低凝期的表现［14］。

为了验证上述推测，接着测定血浆中PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶［15］、F1＋2片段含量［16］。模型组相较于空白组PIVKA-Ⅱ明显升高、谷氨酸羧化酶明显降低，表明机体内肝功能下降导致维生素K含量不足，营养不良。F1＋2片段在20天有提升，在40天和60天有明显下降，结合凝血四项APTT先由20天的升高变为40天、60天的显著降低来推测体内先有微血栓的生成，后面随着肝脏功能负荷逐渐加重，出现DIC的中期的溶解表现，表明血栓的生成与溶解过程，而补气活血方及阳性药物组都可以显著改善这几个指标状况。

在传统教学中英语教师在施教过程中往往采用填鸭式的教学，教师关注学生的笔试多一点而轻视学生的听说能力培养。在新课程理念的指引下，小学英语教师应试着从传统的教学形式中解脱出来，改进教学方式和方法，提高学生的综合素质。但这些愿望的实现需要相关的政策支持与指导。

水资源规划与规划水资源论证的最大不同应体现在“论证”二字，水资源规划是创造性地提出区域水资源的相应规划措施，而规划水资源论证重点是对规划已有内容的一个分析，虽然都涉及水资源配置、水资源管理等内容，但报告编制的概念、工作内容的深度应有所区别，规划水资源论证在提出相关规划调整、修改的结论上不应达到水资源规划的深度。

综上所述，本研究成功复制气虚血瘀大鼠模型，并在此基础上发现具有维生素K缺乏（营养不良）、心肌轻微纤维化、DIC前中期表现，并推断可诱发心功能及肝功能受损等症状。而补气活血方可以显著改善上述状态，并且对肝脏起到了明显的保护作用。验证了补气活血方对治疗低凝状态下气虚血瘀证有着很好的疗效。