Wnt1诱导信号通路蛋白1在胃腺癌中的表达及其意义

董学易，赵秀兰，赵楠，张丹芳，李岩磊，孙保存，2△

胃癌是全球范围内癌症死亡的第3 大原因，早发现、早诊治对于预后至关重要，但多数胃癌患者就诊时已是中晚期，5年生存率不到10%。胃腺癌是胃癌中最常见的一个类型，其容易复发和转移的特性给临床治疗带来了巨大挑战［1］。Wnt1诱导信号通路蛋白1（WISP1）是细胞通讯网络（CCN）蛋白家族中的一员，是一种富含半胱氨酸的分泌型细胞外基质相关蛋白［2］。研究发现，WISP1 作为经典 Wnt/βcatien 通路的靶蛋白，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移［3］。目前关于WISP1 在胃腺癌中的作用及其机制尚不完全清楚。本研究通过收集的临床胃腺癌样本，结合癌症基因组图谱（TCGA）数据库和GEO数据库中的胃腺癌数据集，综合分析WISP1 在胃腺癌中表达及其与预后的关系，以期为临床诊疗提供新思路和潜在靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集天津医科大学肿瘤医院2001年1月—2008 年7 月经手术切除的胃腺癌标本200 例，所有患者术前均未经过放化疗，由2位有经验的病理医师重新阅片确诊为胃腺癌。200例患者中男138例，女62例，年龄28～82岁，平均（60.63±11.52）岁；发生淋巴结转移126 例；有复发和（或）远处转移103例。

1.2 实验材料 兔抗WISP1 抗体（Abcam 公司，ab178547），兔抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体（Santa-cruse 公司，SC-7269），兔抗Twist1 抗体（Santa-cruse 公司，SC-81417），兔抗基质金属蛋白酶（MMP）-2 抗体（Proteintech 公司，10373-2-AP），兔二抗工作液（PV-6001）、封闭用山羊血清（ZLI-9022）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色 石蜡切片（厚度5 μm）采用PV 二步法进行免疫组化染色。切片经二甲苯脱蜡后，用3%无水甲醇过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，梯度乙醇水化，枸橼酸抗原修复液（pH=6.0）修复10～12 min。于山羊血清室温封闭30 min，滴加 WISP1（1∶600），VEGF（1∶100），Twist1（1∶100），MMP-2（1∶400）一抗于4 ℃孵育过夜。次日恢复室温1 h，滴加兔二抗孵育1 h后，3，3-二氨基联苯胺显色10 min，自来水冲洗，苏木素复染细胞核2 min，流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。WISP1 阳性对照选取人胎盘组织，VEGF阳性对照选取人甲状腺组织，Twist1阳性对照选取人肝癌组织，MMP-2 阳性对照选取人神经胶质瘤组织，用PBS 代替一抗作为阴性对照。免疫组化结果判读采用Mattern积分法［4］，每张切片于高倍（×400）显微镜下随机读取5 个视野，计数100 个肿瘤细胞/视野。根据肿瘤细胞的阳性细胞百分率和染色强度评价染色效果。阳性细胞百分率：阳性肿瘤细胞数＜25%记0分，25%～50%记1分，51%～74%记2分，≥75%记3分。染色强度评分：无色记0分，浅黄色记1分，深黄色记2 分，棕黄色或褐色记3 分。两者得分乘积为总评分，≥3分阳性，＜3分为阴性。

1.4 数据库信息分析WISP1 表达 利用GEPIA（Gene Expression profiling interactive analysis，http://gepia. cancerpku.cn/）［5］和UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）在线工具［6］中的表达模块分析TCGA 数据库中胃腺癌数据集（TCGASTAD）中WISP1 的表达水平。其中GEPIA 在线工具表达模块中收录408 例胃腺癌组织、36 例癌旁组织和175 例正常胃组织。UALCAN在线工具表达模块中收录415例胃腺癌组织和34例癌旁组织。从美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GEO 数据库中获得GSE13861 胃腺癌数据集，该数据集包含65 例胃腺癌组织和19 例癌旁组织。基于compare_means 函数进行t检验，通过“ggpubr”R包中的ggviolin进行结果可视化。

1.5 预后分析 针对本中心胃腺癌标本和TCGA-STAD 数据集分析WISP1 与预后的关系。对随访的200 例人体胃腺癌标本进行Kaplan-Meier 生存分析，比较WISP1阳性表达组和阴性表达组患者生存时间的差异；并用GEPIA和UALCAN在线工具的生存分析模块验证TCGA-STAD 数据集中患者WISP1表达水平与生存率的关系。

1.6 WISP1 表达与上皮间充质转化（EMT）和血管生成相关基因的相关性分析 利用人体胃腺癌免疫组化检测和TCGA-STAD 数据集分析 WISP1 与 EMT 相关基因（Twist1、Snail、Vimentin 和 CDH1）和血管生成相关基因（VEGF、CDH5、MMP-2和MMP-9）的关系。利用“TCGAbiolinks”R包下载TCGA-STAD 基因表达矩阵，分析WISP1与EMT相关基因和血管生成相关基因的相关性。

1.7 差异基因富集分析 基于WISP1 表达的中位数，将TCGA-STAD数据集和GSE13861中的样本分为WISP1高、低表达组。利用“limma”R包进行差异分析，对TCGA-STAD 数据集进行基因本体（GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。从生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3 个层面进行GO 分析。此外，利用基因集富集分析（GSEA）软件［7］对TCGA-STAD 和GSE13861分别进行基因集富集分析。

1.8 统计学方法 基于SSPS 16.0软件和R软件（3.6.1版本）进行数据分析。计数资料的比较用四格表χ2检验。计量资料的比较采用2独立样本比较的t检验。患者生存预后的差异比较采用Kaplan-Meier 生存分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WISP1 在胃腺癌中的表达 免疫组化染色结果显示，WISP1主要定位于胃腺癌细胞浆，呈棕黄色颗粒状（图1）。200 例胃腺癌组织中WISP1 阳性表达116例（58%），阴性表达84例（42%）。

Fig.1 The WISP1 expression levels in stomach adenocarcinoma(immunohistochemistry staining,×200)图1 WISP1蛋白在胃腺癌组织中的表达水平（免疫组化染色，×200）

2.2 WISP1 与胃腺癌临床病理特征的关系 不同年龄、性别、肿瘤直径和组织分化程度患者WISP1表达阳性率差异无统计学意义。TNM Ⅲ～Ⅳ期患者WISP1表达阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期者，有淋巴转移患者高于无淋巴结转移者，有远处转移和（或）复发患者高于无远处转移或复发者（均P＜0.05），见表1。TCGASTAD数据集和GSE13861分析结果均显示WISP1在胃腺癌中的表达水平高于对照组，见图2A～D。胃腺癌高分期患者WISP1表达较高，见图2E、F。

Tab.1 The difference of positive WISP1 expression in gastric adenocarcinoma patients with different clinicopathological parameters表1 不同临床病理特征的胃腺癌患者WISP1表达阳性率的差异 ［例（%）］

2.3 生存预后分析 Kaplan-Meier生存分析结果表明，WISP1 阳性表达患者的中位生存时间短于WISP1 阴性表达患者（24 个月vs.52 个月，Log-rankχ2=5.368，P＜0.05），见 图 3A。 同 时 GEPIA 和UALCAN 分析STAD 数据集的结果与此相一致（GEPIA：25 个月vs.49 个月，P＜0.05；UALCAN：25个月vs.48个月，P＜0.05），见图3B、C。

Fig.3 Survival curves of stomach adenocarcinoma with high and low expression of WISP1图3 WISP1高表达和低表达胃腺癌患者生存曲线

2.4 WISP1 与 VEGF、Twist1 和 MMP-2 蛋白表达的关系 VEGF、Twist1 和 MMP-2 蛋白表达于胃腺癌细胞浆内，见图 4。VEGF、Twist1 和 MMP-2 的表达和WISP1阳性表达具有一定程度的关联（P＜0.05），见表2。

Fig.4 The expression levels of VEGF,Twist1 and MMP-2 in gastric adenocarcinoma(immunohistochemistry staining,×200)图4 VEGF，Twist1和MMP-2蛋白在胃腺癌组织中的表达水平（免疫组化染色，×200）

Tab.2 Expression levels of VEGF,Twist1 and MMP-2 in high and low WISP1 expression groups表2 VEGF，Twist1和MMP-2在WISP1阳性组和阴性组间表达的比较 ［例（%）］

2.5 WISP1 与血管生成和EMT 相关基因的相关性 利用TCGA-STAD 数据集进行的相关性分析结果显示：WISP1 与 VEGF、CDH5、MMP-2、MMP-9、Twist1、Snail 和 Vimentin 呈正相关（r分别为 0.64、0.49、0.64、0.32、0.49、0.43、0.64，均P＜0.05），与CDH1呈负相关（r=-0.25，P＜0.05）。

2.6 WISP1 基因GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 按WISP1 表达水平中位数，将TCGA-STAD 数据集分为高、低2 组，并进行差异基因的富集分析。结果显示，WISP1基因参与单核细胞迁移、细胞外基质（ECM）构造和细胞间黏附等生物过程，具有与整合素和胶原结合及细胞因子激活的分子功能（图5A～C）。同时KEGG通路富集分析结果表明，WISP1参与ECM结合和细胞黏附的信号传导通路（图5D）。

Fig.5 Gene Ontology analysis and KEGG pathway analysis图5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

2.7 GSEA富集分析 将GSE13861和TCGA-STAD数据集进行WISP1 高、低表达分组后进行GSEA 分析，结果表明在TCGA和GEO数据库中，当WISP1高表达时，血管生成和EMT 的相关基因上调，高表达的WISP1与血管生成和EMT的发生有关，见图6。

Fig.6 GSEA enrichment analysis of WISP1 and angiogenesis pathway and EMT pathway in TCGA database and GSE13861 dataset图6 TCGA数据库和GSE13861数据集中WISP与血管生成通路和EMT通路富集分析

3 讨论

WISP1 是 Hashimoto 等［8］在研究黑色素瘤细胞时发现的分泌型细胞外基质相关蛋白。现已表明WISP1在口腔鳞癌［9］、胰腺导管腺癌［10］、乳腺癌［11］等肿瘤中高表达，并促进癌细胞的生长与转移，与患者的生存预后密切相关。本研究从蛋白和基因层面，通过对人胃腺癌标本、TCGA-STAD 数据集和GEO数据库中GSE13861 数据集分析等多种方法证实，WISP1 在胃腺癌中的表达高于癌旁组织，在胃腺癌高表达者更容易发生复发和转移，同时生存率明显下降。

Folkman［12］认为肿瘤的生长依赖血管为其提供营养，并且肿瘤的血管生成在其转移和复发过程中起了重要作用。VEGF 可以诱导肿瘤血管生成［13］。基质金属蛋白酶（MMPs）可通过降解细胞外基质而促进肿瘤转移，其中MMP-2可降解基底膜和Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型胶原以及溶解明胶［14］。MMP-9能够水解细胞外基质和基底膜的主要成分Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原、黏连蛋白等，并且MMP-2和MMP-9可以协助VEGF发挥诱导肿瘤血管生成的作用［15］。CDH5是一种表达于内皮细胞之间的黏附分子，在维持血管完整性、调控内皮细胞连接和血管的形成中起着重要的作用［16］。本研究中，免疫组化染色结果表明，VEGF、MMP-2 和WISP1 的表达具有一定程度的关联，在WISP1 高表达组中伴随VEGF 和MMP-2 的高表达。TCGA-STAD 数据集相关分析说明WISP1 表达与VEGF、CDH5、MMP-2 和 MMP-9 呈正相关。另外WISP1 的GO 功能分析和KEGG 通路差异基因富集分析证实，WISP1 参与细胞外基质的构造过程。同时GSEA 富集实验结果表明，WISP1 高表达与血管发生相关。综合这些结果表明，WISP1 可能具有促进胃腺癌血管生成的潜力。

EMT即上皮性来源的细胞失去原有表型而获得间充质表型，并经历细胞骨架重塑的过程。EMT 的细胞标志事件是细胞中E-cadherin（CDH1）等黏附蛋白表达降低，导致细胞间的桥粒连接减弱，同时伴有间充质特性的标志物Vimentin 等表达增加，细胞的迁移能力增加。其中Twist1 和Snail 是启动组织发生EMT 的重要转录因子。本研究中免疫组化染色结果证实，Twist1和WISP1表达具有一定关联，并且对TCGA-STAD 数据集的分析显示，WISP1 表达水平与 Twist1、Snail 和 Vimentin 呈正相关，与 CDH1呈负相关；另外WISP1的GO功能分析和KEGG通路差异基因富集分析证实，WISP1 参与细胞黏附功能和单核细胞的迁移过程；同时GSEA 富集实验结果表明，WISP1 高表达与EMT 发生相关。笔者推测WISP1 可能通过EMT 过程促进胃腺癌的转移。Jia等［17］研究证实，WISP1可使胃癌细胞发生EMT，促进胃癌细胞增殖、转移和侵袭。本课题组前期研究亦证实，EMT参与胃癌血管生成拟态过程，而血管生成拟态是胃癌发生转移的重要环节之一［16］。上述结果为WISP1促进胃腺癌发生转移和侵袭提供了更有力的证据。

综上所述，WISP1在胃腺癌组织中高表达，并且在淋巴结转移，远处转移和（或）复发的胃腺癌组织中高表达，高表达的WISP1患者生存预后差；WISP1可通过促进胃腺癌的血管生成和启动胃腺癌细胞发生EMT，促使胃腺癌发生转移。WISP1 通过多个途径发挥作用，最终导致胃腺癌患者发生不良的预后。然而，关于WISP1 在胃腺癌中如何调控VEGF、Twist1、MMP-2 的表达以及相关通路的相互作用还需进一步研究。