单细胞测序技术及其在结直肠癌中的应用

郑磊 ，路佳

结直肠癌是常见的胃肠道肿瘤之一，其发病率随着年龄的增长而增加。根据最新癌症统计结果，结直肠癌是世界第三大常见的恶性肿瘤，位居肺癌和胃癌之后［1］。30%～50%的新确诊患者已进展为转移性结直肠癌，其 5 年生存率仅为 50%～60%［2］。肿瘤异质性是由于单个肿瘤内的细胞出现不同程度的分化，导致的癌细胞之间遗传和分子特征的差异［3］，其在癌症的形成和发展过程中起重要作用。结直肠癌具有高度异质性，传统的研究方法仅能对整个肿瘤组织进行分析，无法在单细胞水平比较肿瘤内的差异［4］。单细胞分离和测序技术以单个细胞为研究对象，能够对细胞异质性进行较为深入的研究［5］。单细胞分离技术结合高通量测序技术使得解析肿瘤组织的异质性分子特征成为可能，可应用于基础研究、临床诊断和药物开发领域［6］。此外，它还可用于发现异常增生的细胞类型，以寻找结直肠癌新的发病机制［7］。本文对单细胞测序技术及其在结直肠癌中的应用进行系统综述。

1 单细胞测序技术简介

根据样本类型，单细胞测序技术可分为单细胞基因组测序和单细胞转录组测序。目前已经开发了不同的方法进行单细胞捕获和文库构建，每种方法均有各自的技术特点。单细胞基因组测序技术中的多次退火环状循环扩增技术能够对分离的单细胞中的微量全基因组DNA进行高效扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序。单细胞转录组测序技术 Smart-seq2、液滴测序（Drop-seq）、10×Genomics 等能够满足高灵敏度、低偏好性的cDNA扩增，具有一定的应用前景。

1.1 单细胞测序样本制备 单细胞样本制备主要有细胞团及组织获取、细胞悬液制备、单细胞分类、单细胞分散到独立容器4个步骤。不同的样本类型制备单细胞的方法各不相同，单细胞捕获质量决定了单细胞测序技术的通量和成本。单细胞捕获最初采用纤维吸取或激光捕获显微分离技术分离单个细胞，特定类型的单细胞也可以通过荧光激活细胞分类术（fluorescent activated cell sorting，FACS）分离到孔板中。基于微孔或液滴的微流控高通量方法Drop-seq利用微流控装置将带有条形码的微珠和细胞一起装入微液滴，将液滴分割成纳升大小的反应室，条形码随后会连接到反转录后的cDNA上，由此可检测数以千计的细胞，提高了分离细胞的通量和效率［8］。

通过单细胞捕获后得到的单个细胞悬液可进行相应细胞类型的细胞原代培养，根据细胞类型选择相应的培养条件。经过培养的低代次的细胞在细胞状态上基本与体内性状差异不大，而且可以有效去除前期分散处理过程中的死细胞和细胞碎片，恢复一定的细胞活力。经过原代培养后，可通过显微镜挑取单细胞于EP 管中，或通过流式细胞仪进行分选，选择活力好的细胞群，分选单细胞于96孔板中，用于单细胞测序分析［9］。

1.2 单细胞建库及测序

1.2.1 单细胞全基因组建库测序 由于人类单个二倍体细胞中能分离出的DNA含量极少，因此需要进行全基因组扩增（whole genome amplification，WGA），以满足高通量测序的样本量需求［9］。在单细胞全基因组建库及测序中，WGA是其关键步骤。常用的WGA 技术有：（1）简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）。DOP-PCR 是一种特殊的PCR，由于是指数扩增，因此对细胞基因组的物理覆盖率一般低于10%［10］。（2）多重置换扩增（MDA）。MDA 是一种利用phi29聚合酶对基因组进行指数扩增的技术，对单细胞基因组或外显子组物理覆盖率大于90%［10］，解决了基于PCR 扩增带来的偏倚。（3）Nucseq。Nuc-seq是2014年由Wang等［11］开发的全基因组和外显子组单细胞测序方法，该方法通过检测G2/M期细胞核，使细胞基因组平均覆盖率达到了91%。

1.2.2 单细胞全转录组建库及测序 单细胞转录组建库过程为：捕获和裂解单个细胞，将释放的mRNA反转录成cDNA，随后通过多聚胸腺嘧啶、T 重复寡核苷酸启动方法进行扩增，以构建测序文库。双链cDNA 合成可直接通过PCR 实现，但可能引入扩增偏差。因此，科学家们利用莫洛尼鼠白血病病毒转录酶的链转换活性开发了模板切换技术，包括STRT-seq 和 SMART-seq/Smart-seq2，以减少 3'覆盖偏差。其他方法如CEL-seq、CEL-seq2 和MARS-seq，通过将T7启动子并入寡核苷酸引物中，在第二链合成后进行体外转录以线性扩增。在Illumina 测序平台上制备测序文库也需要片段化和适配器合并［12］。

单细胞全转录组测序可进行3'、5'端和全长测序，需根据研究目的选择合适的测序平台。全长测序方法如Smart-seq2，在基因表达检测中显示出更高的灵敏度，并且能够检测剪接转录变体和T/B 细胞受体（TCR/BCR）序列［13］。该技术的通量较低，成本较高，而InDrop、Drop-seq 或10×Chromium 等3'端测序方法，可同时取样数千个细胞，更适合于细胞类型和标记的鉴定。既往研究表明，测序深度可能会影响灵敏度，但不会明显影响细胞分型的准确性［13］。一般而言，每个细胞读取50 000次就足以进行无偏差细胞聚类和标记识别。

2 单细胞测序在结直肠癌中的应用

肿瘤异质性是癌症诊断和治疗的关键。由于肿瘤组织是不同细胞的混合体，因此传统测序通常难以对癌症患者的肿瘤组织进行异质性分析。单细胞测序使基因表达谱在细胞水平上得以实现，是研究结直肠癌异质性的重要手段，能够为结直肠癌的防治提供新的思路。

2.1 结直肠癌分型 单细胞测序技术能通过鉴定单个肿瘤细胞中的基因组改变和特有转录组水平来研究肿瘤异质性，因此单细胞测序技术可以通过检测结直肠癌中的基因表达水平，对结直肠癌进行分型。Dai 等［14］对1 例Ⅲ期结直肠癌患者癌组织中的2 824个细胞进行分析，并通过单细胞转录组测序将其聚类为5 个不同的簇，发现每个簇的基因具有不同的功能且富集到不同的基因本体术语中，各个簇之间表现出明显的异质性，即每个簇能代表一种结直肠癌的分子类型。Zhang 等［3］通过单细胞转录组测序检测来自结直肠癌患者的肝转移癌组织和癌旁正常组织，共鉴定出6种细胞类型的12个簇，包括癌细胞、T 细胞、髓样细胞、内皮细胞、成纤维细胞和B细胞。Li等［15］对来自11例结直肠癌患者的969个原发肿瘤细胞和7 例癌旁正常黏膜的622 个细胞进行单细胞转录组测序，参考成分分析（RCA），获得了7个不同的细胞簇，分别为上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、B 细胞、T 细胞、肥大细胞和髓样细胞。此外，通过单细胞转录组测序得到的差异表达基因和通过批量分析鉴定得到的差异表达基因一致，但在单细胞测序中鉴定出的一些差异表达基因在批量分析中未被检测到，表明单细胞测序技术能更全面地检测患者的基因表达情况，进而在分子基础上对患者进行分型。因此，通过对肿瘤单细胞转录本进行研究，可以进一步完善现有的结直肠癌分类系统，有助于提出新的结直肠癌分子分型模型。

2.2 循环肿瘤细胞分析 循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是在癌症患者的血液中发现的肿瘤细胞，该细胞具有完整的核，表达细胞角蛋白，但不表达CD45（白细胞标记，可以作为CTC 筛选的分子标记）。研究表明，CTC 不仅与临床病理特征相关，还具有预测预后的价值［16］。用于CTC分析的结直肠癌患者血液来源包括肠系膜、门静脉或外周静脉血。随着单细胞测序技术的发展，结直肠癌患者的CTC可进行基因组和转录组水平上的多角度基因表达分析。例如，比较基因组杂交技术可以在单个CTC 中分析 DNA 拷贝数的变异［17］。CTC 的单细胞转录组分析，在将RNA 反转录为cDNA 后，需要进行扩增，然后使用微阵列或下一代测序进行基因表达分析［16］。Wang 等［17］开发了新的单细胞测序平台ChimeraX®-i120，利用该平台检测CTC 具有高灵敏度、准确性和可重复性的优势，在结直肠癌中，CTC阳性检出率超过60%，而在健康人血液中很少发现CTC。在 Heitzer 等［18］研究中，从 6 例晚期结直肠癌患者的血液样本中分离出了CTC，并将原发肿瘤的基因组图谱与每例患者的肝转移和CTC图谱进行比较，发现在CTC 与原发灶和肝转移灶间，一些基因，特别是已知的结直肠癌驱动基因（如KRAS、APC、PIK3CA）的拷贝数变化具有相似之处。通过对原发灶和相应的肝转移组织进行深度测序发现，CTC 中的特有突变在原发和转移组织中也存在亚克隆水平突变。这些研究表明了分离和表征CTC 的重要性，因其携带了癌症患者疾病发展过程中形成的突变，可以作为液体活检来监测治疗反应，也有助于患者的个体化治疗。然而，CTC 不一定携带与原发肿瘤相同的突变，这种不一致性可能是结直肠癌患者对化疗反应存在差异的原因。随着研究的发展，未来CTC将可能用于推进结直肠癌的个性化治疗以及复发监测。

2.3 结直肠癌转移中的研究 结直肠癌的高转移率是导致患者死亡的重要原因［19］,但目前已批准用于治疗转移性结直肠癌的靶向治疗方法不多，且已知的靶向药物对于BRAF 和PIK3CA 等基因的突变疗效甚微［20］。选择何种技术对转移性结直肠癌的复杂特性进行研究成为开发新的诊断标志物和药物治疗靶点的关键［21］。与传统转录组测序相比，单细胞转录组测序能够根据细胞类型提供特异的诊断和预后标志物以及个体化抗癌药物的治疗靶点。Bian等［22］在2018 年建立了单细胞三体组测序（scTrioseq）技术，该技术能够从单个细胞层面同时检查突变、转录和甲基化；该研究对来自10 例结直肠癌患者（Ⅲ或Ⅳ期）的原发肿瘤和转移瘤进行了scTrioseq测序，为研究肿瘤进化与基因谱系相关的表观改变提供了新的方法，并证实了在谱系中DNA甲基化水平表现出一致的上调或下调，而在各个谱系之间DNA甲基化的上下调趋势可能存在较大差异。Ono等［23］对来自小鼠结直肠癌模型中的200个肿瘤细胞进行单细胞外显子组和转录组测序，以鉴定肿瘤异质性，并研究了单个细胞如何产生肿瘤异质性；该研究从体外培养的类器官中分离单个结直肠癌细胞，移植到小鼠体内，成瘤后行单细胞测序，发现由于出现新的转录亚群，肿瘤细胞转录组的异质性有所升高，这些亚群抑制了间充质标记基因的表达，说明新的细胞亚群具有上皮间质转化特性；同时研究还发现，在具有类似表达特征的人类患者中，结直肠癌有显著的转移趋势，揭示了结直肠癌转移时肿瘤细胞上皮间充质转化的转化机制。Leung 等［24］利用单细胞DNA 测序技术发现在转移性结直肠癌患者中存在二次转移现象，说明肿瘤转移灶仍然处于不稳定状态。王智锋［25］利用单细胞测序检测结直肠癌原发灶和转移灶的突变情况，发现SMAD4基因的突变是驱动肿瘤转移的关键基因；此外，这项研究还发现结直肠癌转移灶中存在与细胞有丝分裂检查点调控相关基因DLG2的突变，说明转移的肿瘤细胞仍然保留侵袭能力。因此，利用单细胞测序技术鉴定结直肠癌转移过程中关键的分子特征具有重要的研究价值。

2.4 结直肠癌化疗耐药性机制探索 化疗耐药性是影响结直肠癌患者预后的重要因素，化疗耐药细胞的形成通常归因于治疗前后肿瘤中罕见的耐药性克隆［26］。这些具有耐药性的结直肠癌细胞能够破坏药物转运，使细胞调节过程失调，通过遗传或表观遗传修饰改变患者的药物敏感性和治疗靶点［27］。根据基因表达、表观遗传学、通路特征和治疗反应来研究化疗耐药性癌细胞，已成为当前的研究热点［27-28］。

常规转录组研究可以挖掘化疗耐药有关的基因表达特征，但得到的结果只能体现组织水平的平均情况，忽略了基因表达的细胞特异性［29］。单细胞转录组分析能够研究单个细胞的转录组，更适合于细胞特异性精确治疗。Chen 等［30］研究证实了单细胞RNA测序能够表征类器官中4种不同类型的细胞亚型的耐药能力，包括奥沙利铂治疗后的药物诱导组、药物不敏感组、药物敏感组和药物超敏感组；单细胞测序结果显示，对肿瘤类器官进行药物治疗会引起不同亚型间的差异反应，药物不敏感组细胞占所有4 组细胞的百分比在药物治疗后有所增加，而药物敏感组治疗后细胞百分比降低；对这些亚型进行差异表达基因及通路富集分析，进而通过聚类对结直肠癌进行详细分类，能够更好地为可能或已经表现出化疗耐药性的结直肠癌患者选择治疗方案。由此可见，单细胞RNA测序有望用于预测抗肿瘤药物的有效性，进而指导用药，甚至用于预防化疗耐药。

2.5 肿瘤微环境与免疫治疗 肿瘤微环境由多种类型细胞组成，包括免疫细胞、炎性细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，以及肿瘤内部和周围的非细胞成分。肿瘤微环境中的细胞成分已经成为肿瘤进展、器官特异性转移和治疗反应的关键调节剂，其中肿瘤浸润免疫细胞是免疫治疗的关键［31］。由于肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）可直接影响预后和对免疫治疗的反应而受到极大关注［32］。多项研究表明，通过免疫评分策略，TIL 的类型、位置和丰度可用于预测结直肠癌患者的总体生存期和无进展生存期［33］。在原发性人类肿瘤中基于单细胞测序的转录组分析不仅揭示了T 细胞异质性，而且通过整合转录组和T 细胞受体的分析阐明了T 细胞群之间的动态关系，为预测免疫治疗疗效和患者预后提供了证据［34］。Zacharakis 等［35］对 1 例晚期乳腺癌患者的肿瘤细胞的全基因组进行测序，从肿瘤细胞里寻找能够识别突变基因及其表达蛋白的TILs，经过筛选，将能够有效识别4 种突变的TIL 进行体外扩增后回输到患者体内，联合标准免疫治疗方案，取得了良好的疗效，患者在治疗22 个月后肿瘤组织全部清除。由此可见，肿瘤微环境的研究能够为肿瘤患者提供一种有效的治疗手段。单细胞测序技术的应用对于复杂的肿瘤微环境研究具有重要作用。Zhang 等［32］通过单细胞测序技术获得了11 138 个单个T 细胞的转录组，开发了STARTRAC（single T cell analysis by RNA sequencing and TCR tracking）的生物信息学分析方法，定量分析具有不同功能和克隆性的20 个T 细胞亚群之间的动态关系，进而利用该方法对12例结直肠癌患者的癌组织、癌旁组织以及外周血中的20类不同类型T 细胞进行追踪，揭示了T 细胞的组织分布特性、克隆增生、迁移和状态转化关系，发现了结直肠癌独特的TIL 细胞。研究发现除肿瘤微环境外，TCR 也会影响肿瘤浸润CD8+效应记忆T 细胞向“耗竭性T 细胞”和效应T 细胞的转化［32］，这是目前国际上对结直肠癌肿瘤微环境中单个T细胞规模最全面深入的研究。通过对原发性结直肠癌和对应的正常结直肠黏膜组织细胞进行单细胞转录组测序，Li等［36］开发了RCA算法，鉴定了两种不同的结直肠癌相关成纤维细胞亚型，发现通过传统转录组学测序分为同一亚型的患者具有不同的生存率，大大提高了这种算法在预测预后中的价值。de Vries 等［37］分别在结直肠癌组织、肿瘤相关淋巴结、正常黏膜组织和结直肠癌患者外周血样本中，通过应用流式细胞术在单细胞水平检测36种免疫标记物的表达，揭示了各种免疫细胞在不同样本中的分布情况。Zhang 等［34］使用 Smart-seq2 和 10×Genomics 两种单细胞测序方法分析人类原发性结直肠癌的免疫和基质细胞群，揭示了结直肠癌内髓系T 细胞和髓系间质的联系，为进一步探索肿瘤浸润性免疫细胞提供了一种新的思路。除免疫T 细胞外，结直肠癌中B细胞特征的研究也能为结直肠癌肿瘤微环境中的免疫生态系统提供新见解。由于胃肠黏膜的免疫系统长期暴露于食物性抗原和细菌中，胃肠黏膜抗原驱动的免疫保护主要归因于产生抗体的B细胞和浆细胞。Wang 等［38］通过对结直肠癌原发肿瘤和邻近正常黏膜组织的约6 000 个免疫细胞进行全长Smartseq2 分析发现，IgA+免疫球蛋白Lambda 恒定区2+（IGLC2+）浆细胞与结直肠癌预后不良有关，而以往研究忽视了分化为IgA+IGLC2+浆细胞的B 细胞亚型在癌组织和非癌组织中的异质性，导致不同结直肠癌中 B 细胞的研究结果存在差异。Zhou 等［39］对 21例微卫星稳定结直肠癌患者和6例无癌老年人进行了单细胞多组学测序，发现在肿瘤微环境和正常组织中的免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞中普遍存在体细胞拷贝数改变（SCNA），肿瘤中SCNA 的成纤维细胞比例远高于邻近正常组织的比例（11.1%～47.7%vs.1.1%～10.6%）。此外，研究鉴定出5 个基因：BGN、RCN3、TAGLN、MYL9和TPM2，其作为成纤维细胞特异性的生物标志物，如表达上调预示预后较差。这些研究表明，未来单细胞测序技术能够在探索免疫细胞多样性、研究免疫治疗机制中发挥重要作用。

3 展望

单细胞测序技术在细胞水平探索结直肠癌的发生发展机制，将成为今后研究的热点。在基础研究方面，单细胞测序技术能够揭示结直肠癌发生发展过程中不同类型细胞的突变、表达、表观水平的变化，进一步阐明结直肠癌形成的分子机制。在临床研究方面，运用单细胞测序技术筛选和验证大量肿瘤异质性相关的变异，既可以发现新的药物靶点，又可以开发出针对个体化药物敏感性的预测性生物标志物，为开发精准和个性化的癌症治疗方法提供关键信息。尽管目前单细胞测序技术仍处于发展阶段，有关结直肠癌单细胞测序方面的公开研究较少，但随着大规模基础和临床研究的逐渐深入，单细胞测序技术会对癌症患者的治疗产生深远的影响。