HPLC测定蔬菜农药残留的不确定度评定

史凌云

（泽州县综合检验检测中心 山西晋城 048000）

涕灭威和克百威属于氨基甲酸酯类农药，被广泛应用于蔬菜、水果等农作物的病虫防治。在使用农药提高农作物产量，造福人类的同时，过量的农药残留带来的危害也引起了人们的重视[1]。通过高效液相色谱法对蔬菜中的涕灭威、克百威农药残留进行检测[2-4]，其结果对照GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药残留最大限量》可判定试样中农药残留是否超标，以为人们的日常生活提供一定的质量保障。本文通过分析检测过程中的不确定度来源及其对测定结果的影响，为正确评价、使用测量结果和规范实验室的质量管理和控制提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（柱后衍生反应装置和荧光检测器）、氮吹仪、高速匀浆机、梅特勒PL202-L型天平、氨基固相萃取小柱、10 mL容量瓶（A级）、移液枪（100 μL～1 000 μL）、50 mL量筒（A级）、10 mL刻度移液管（A级）、5 mL刻度移液管（A级）。

1.1.2 试剂

涕灭威和克百威标准物质（国家标准物质中心），浓度均为1 000 mg/L；乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷，均为色谱纯；OPA稀释剂、邻苯二甲醛、巯基乙醇，均为Pickering生产；0.05 mol/L NaOH溶液。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 mm。柱温：50 ℃。荧光检测器：λex=330 nm，λem=465 nm。柱后衍生：0.05 mol/L NaOH溶液，流速0.5 mL/min；OPA试剂，流速0.5 mL/min。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

依据NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》第3部分，称取25.0 g 样品放入匀浆机中，加入50.0 mL 乙腈，在匀浆机中高速匀浆2 min 后用滤纸过滤，滤液收集到装有5 g～7 g 氯化钠的100 mL 具塞量筒中，收集滤液40 mL～50 mL，盖上塞子，剧烈振荡1 min 后，在室温下静置30 min，使乙腈相和水相分层。从100 mL 具塞量筒中准确吸取10.00 mL 乙腈相溶液，放入150 mL 烧杯中，将烧杯放在80 ℃水浴锅加热，并向杯内缓缓通入氮气，将乙腈蒸发近干；加入2.0 mL 甲醇+二氧甲烷（1+99）溶解残渣，盖上铝箔，待净化。将氨基柱用4.0 mL 甲醇+二氧甲烷（1+99）预洗条件化，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即加入上述待净化溶液，用15 mL 离心管收集洗脱液。用2 mL 甲醇十二氧甲烧（1+99）洗烧杯后过柱，并重复一次，将离心管置于氮吹仪上，水浴温度50 ℃，氨吹蒸发至近干，用甲醇准确定容至2.5 mL。在混合器上混匀后，用0.2 μm 滤膜过滤，待测。

1.3.2 标准溶液的稀释

用1.0 mL 的移液枪吸取1.0 mL 浓度为1 000 mg/L 的标准物质母液于10 mL 容量瓶中，配制成100 μg/mL 的标准物质储备液。用1.0 mL 的移液枪吸取1.0 mL 的标准物质储备液于10 mL 容量瓶中，配制成10 μg/mL 的标液，用于加标回收率的测定和工作液的配制。用移液枪吸取100 μL 的标液于10 mL 的容量瓶中，配制成0.1 μg/mL 的工作液。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

不确定度来源主要有三类：（1）标准溶液，相对标准不确定度符号为Urel标；（2）样品前处理，相对标准不确定度符号为Urel前；（3）色谱仪，相对标准不确定度符号为Urel仪。

2.2 不确定度的评定

2.2.1 标准溶液引入的不确定度

（1）标准物质纯度

自国家标准物质中心购买浓度均为1 000 mg/L 的涕灭威和克百威的标准物质，其定值的扩展不确定度均为2%，k=2，属于B 类评定，则涕灭威和克百威的标准物质纯度引入的相对标准不确定度均为： Urel标1=2%/2=0.01。

（2）标准溶液稀释配制过程

涕灭威和克百威工作液配制过程相同，均用甲醇少量多次冲洗后转移至容量瓶中[5]。

对于移液枪（100 μL～1 000 μL），根据检定证书提供的信息，其100 μL 时的重复性误差为1.6%，按均匀分布处理，其1 000 μL 时的重复性误差为0.2%，按均匀分布处理，。

依据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》，单标线10 mL 容量瓶（A 级）的容量允差为±0.02 mL，按三角分布处理，。

则涕灭威和克百威标准溶液稀释过程引入的相对标准不确定度均为：

（3）标准溶液引入的相对标准不确定度

涕灭威和克百威标准溶液引入的相对标准不确定度均为：

2.2.2 样品前处理引入的不确定度

（1）称量

试样称量过程中所用的天平为梅特勒PL202-L 型，其最小分度值为0.01 g。由于天平的精密度不是太高，在称量过程中数显很稳定，因此，忽略称量重复性引入的不确定度。天平的最大允许误差为±0.05 g，按均匀分布处理，则由称量引入的相对标准不确定度为：

（2）提取、净化、定容

整个过程中，实验室温度在±3 ℃内变化，用到试剂为乙腈（体积膨胀系数为0.001 37/℃）和甲醇（体积膨胀系数为0.001 10/℃）[6-7]，视温度变化按均匀分布处理，得到温度变化下试剂体积膨胀引入的相对标准不确定度见表1。

提取、净化、定容过程中用到的玻璃量具，JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》对其均有相应的最大允差。按均三角分布处理，由此得到器具相对标准不确定度见表1。

表1 提取、净化、定容过程中的不确定度

（3）样品提取、净化过程（回收率）。

在检测涕灭威和克百威于试样中的残留时，对于氮吹、萃取等过程中引入的不确定度，可选择在6 组质量为25.0 g 的试样中添加0.03 mg/kg 涕灭威和克百威的标准溶液，计算其回收率来评定。标准偏差运用极差法计算，极差系数为2.53。

涕灭威的回收率为：91.1%、88.9%、86.7%、90.5%、89.2%、87.5%；其中mg/kg，mg/kg，

克百威的回收率为：105.1%、106.4%、103.8%、100.2%、105.4%、106.3%；其中=0.009 6。

（4）样品前处理引入的相对标准不确定度

2.2.3 色谱仪检测过程引入的不确定度

（1）高效液相色谱仪

根据仪器检定证书的数据，6 次的定量重复性误差为1.96%，则色谱仪引入的相对标准不确定度为 urel,LC= 0.008。

（2）峰面积差异

因衍生设备未强制检定，则对峰面积差异引入的不确定度评定时，只考虑试样的重复测量来评定。将0.10 mg/L 的涕灭威和克百威的工作液重复测量6 次，涕灭威峰面积（单位：mV*min）分别为480 669、480 635、480 614、480 625、480 618、480 602，均值为480 627，极差为67；涕灭威峰面积（单位：mV*min）分别为333 548、333 597、333 554、333 588、333 536、333 524；均值为333 554，极差为73。

测量6 次时的极差系数为2.53，则涕灭威的标准不确定度为u涕重=67÷2.53=26.48，相对标准不确定度为 urel涕重=26.48÷480 627=0.000 055；同理可得克百威的标准不确定度u克重=73÷2.53=28.85 ，相对标准不确定度urel克重=28.85÷333 554=0.000 086。

（3）色谱仪检测过程中的不确定度

色谱仪检测过程中的不确定度来源有仪器本身引入的不确定度和峰面积差异引入的不确定度，峰面积差异引入的相对不确定度可忽略不计。

2.3 总相对标准不确定度和相对扩展不确定度

修约后涕灭威和克百威的合成标准不确定度均为0.020，则相对扩展不确定度均为Urel=0.040（k=2）。

2.4 测定结果

经实验数据得到试样中涕灭威的最佳估计值为ω涕=0.03 mg/kg，其扩展不确定度为U涕=Urel×ω涕=0.040×0.03 mg/kg=0.001 2 mg/kg，故此次测量试样中涕灭威含量为（0.03±0.001 2）mg/kg，k=2。同理试样中克百威的最佳估计值为ω克=0.025 mg/kg，其扩展不确定度为U克=Urel×ω克=0.040×0.025 mg/kg=0.001 0 mg/kg，此次测量试样中克百威含量为（0.025±0.001 0）mg/kg，k=2。

3 结语

分析检测涕灭威和克百威在试样中残留的各个步骤，发现影响整个过程不确定度的主要因素为标准物质的稀释过程和前处理过程。因此，实际中要按照标准物质的贮存要求来保存标准物质及其储备液；在检测过程中，检验人员要规范器具使用动作，严格控制前处理中提取、净化、定容步骤中的操作。虽然仪器本身引入的不确定度比较小，但也要做好仪器设备的检定、期间核查及日常维护工作，在测试前做好色谱仪的平衡工作。实验的每一个步骤都不可大意，要严格按照作业指导书规范自己的操作，以减小测定结果的不确定度。