湘潭市屠宰场沙门氏菌分离鉴定及耐药性分

周 政

（湘潭市易俗河镇农技农机畜牧水产推广服务中心，湖南 湘潭 411228）

沙门氏菌属于肠杆菌科成员之一，该病原广泛存在于自然环境中，可感染多种动物，其中包括猪、禽和反刍动物等。此外，人对该病原也易感，且人类感染该病原后可出现严重的临床症状，包括恶心、呕吐和浑身乏力等，严重时导致败血症，甚至威胁生命[1]。截至目前，科研人员发现沙门氏菌属有超过2 600种血清型，但也只有部分血清型沙门氏菌可感染人，如鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌[2-3]。据报道，消费者发生食源性细菌病中毒主要是由沙门氏菌感染引起的，而欧洲消费者感染沙门氏菌病部分原因是与食用被该病原污染的猪肉有关[4]。由于沙门氏菌的感染途径主要是水平传播，环境中存在沙门氏菌对消费者健康也会造成一定的威胁。

随着人们对食品安全越来越重视，目前国内有研究人员开始关注屠宰场生猪肉品或环境中沙门氏菌的污染情况。邱燕等2016年对贵州部分地区屠宰场猪肉样品进行检测发现，该地区屠宰场猪肉中沙门氏菌检出率为14.0%（7/50）[5]；韩依辛等对广东省部分地区屠宰场猪肉样品检测结果显示，498份样品中有70份为沙门氏菌检测阳性，检出率为14.06%[6]。本研究于2020年5—8月从湘潭县部分生猪屠宰场共采集90份样品进行沙门氏菌分离鉴定及药敏试验，旨在为该病的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2020年5—8月从湘潭县3个生猪屠宰场共采集90份样品，其中包括猪肉样品58份和环境样品32份。猪肉样品主要采集扁桃体、淋巴结或肺脏等，每份样品约30 g，标记后置于封口袋中；环境样品主要是生猪剖杀台和猪肉分割台，用无菌棉签蘸取少量灭菌PBS溶液后，在剖杀台或分割台表面进行来回涂抹，涂抹面积为25～30 cm2，其后将棉签置于封口袋中并标记。所有样品低温运输至湘潭县动物疫病预防控制中心，待检。

1.2 样品处理及细菌分离鉴定

取生猪组织样品（0.8～1 g）与适量PBS溶液混合后进行研磨，离心后取50 μL上清液放入SC增菌培养液中进行细菌增殖；环境样品所用棉签与适量PBS混合后，取100 μL上清液置于增菌培养液中培养。其后，采用沙门氏菌检测试纸对以上样品分别进行检测。

将试纸条检测为阳性的样品进行细菌分离鉴定：用接种环蘸取少量菌液在麦康凯培养基表面划线，37 ℃恒温箱培养24 h，观察菌落生长情况；其后挑取疑似菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌株形态学特征。

1.3 沙门氏菌16S rRNA基因扩增、测序及分析

将形态学鉴定为沙门氏菌的菌株在营养培养基中增菌后，取200 μL菌液煮沸以获得细菌基因组。以细菌基因组为模板，通过PCR法对细菌的16S rRNA基因序列进行扩增，其体系（50.0 μL）包括：2×PCR mix 25.0 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板3.0 μL及双蒸水20.0 μL；反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后取5.0 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性PCR产物送至上海生工进行测序，获得测序结果后，将序列进行拼接，其后在NCBI上将获得序列进行同源性BLAST比对分析。

1.4 血清型分型及药敏试验

采用玻片凝集试验及沙门氏菌属诊断血清的O、H和Vi抗原抗血清反应对本试验获得的沙门氏菌分离株进行血清型鉴定，其判定标准参考Kauffmann-White方案。

严格按照CLSI标准对本试验获得的沙门氏菌菌株进行药敏试验。以多环西素、头孢唑林、林可霉素、克林霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、多黏菌素B、氨苄西林、头孢拉定、头孢噻肟和氨曲南作为菌株抗生素敏感型试验抗生素。具体操作过程为：将以上菌株分别在普通琼脂培养基中扩增后，将其稀释至1×106cfu/mL，取100 μL菌液涂布于培养基表面，待菌液稍干后贴上含有不同抗生素的药敏纸片，其后将培养基置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h。最后用游标卡尺衡量不同抗生素纸片的抑菌圈直径，根据药敏纸片产品说明书判定菌株对该抗生素的敏感性。

2 结果

2.1 沙门氏菌分离及鉴定

本试验从湘潭县3个屠宰场采集环境或猪肉样品共90份，对样品中细菌性病原进行初步扩增后，用沙门氏菌检测试纸对以上样品进行检测，结果发现有9份样品检测为阳性，其阳性率为10.0%；其后我们对以上阳性样品进行病原分离及革兰氏染色鉴定，最终可确定9个样品分离菌株疑似为沙门氏菌，该菌株在麦康凯培养基表面可形成无色、表面光滑的圆形菌落，革兰氏染色可发现两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌（图1）。其后，对以上菌株进行扩增后，提取DNA基因组，应用PCR技术对菌株16S rRNA基因序列进行扩增、测序及分析，结果发现本试验获得的9个菌株均被鉴定为沙门氏菌。

图1 沙门氏菌革兰氏染色镜检结果

2.2 湘潭县屠宰场来源样品沙门氏菌污染情况

通过数据统计，结果表明90份被检样品中有9份样品被沙门氏菌污染，平均检出率为10.0%（9/90）；其中3个屠宰场被污染样品数量分别为1份、5份和3份，其检出率分别为3.3%（1/30）、16.7%（5/30）和10.0%（3/30）；此外，90份样品可分为环境样品（32份）和猪肉样品（58份），检测为沙门氏菌阳性的样品数量分别为5份和4份，检出率分别为15.6%（5/32）和6.9%（4/58），见表1。

表1 湘潭县屠宰场来源样品沙门氏菌污染情况

2.3 药敏试验结果

进一步的药敏试验结果表明，本试验分离的9个沙门氏菌毒株对不同抗生素敏感性具有一定差异，具体结果如表2所示，所有沙门氏菌对多环西素和头孢唑林均产生耐药性，耐药率为100.0%；对克林霉素、林可霉素和氨苄西林的耐药率均超过50.0%，分别为88.89%、88.89%和77.78%；对多黏菌素B、氧氟沙星和恩诺沙星等药物相对敏感，其耐药率分别为0、22.22%和11.11%。

表2 分离的沙门氏菌菌株对不同抗生素药敏试验结果

3 讨论

尽管目前人们对食品卫生安全问题逐渐重视，但生猪在饲养和屠宰等环节仍然容易受到病原菌感染或污染，且部分病原菌具有感染人的能力，如大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等，这类致病菌感染（污染）猪（肉）不但可影响猪肉品质，还可能对消费者健康造成威胁。沙门氏菌属于重要的人畜共患性致病菌，且该致病菌在猪场十分常见，但肥育猪感染该病一般不表现临床症状，这导致有些外观健康的屠宰猪带菌，消费者接触或食用带菌肉类后就有可能会感染该病。方忠意等对河南地区部分屠宰场外观健康屠宰场盲肠组织内容物进行细菌分离鉴定，结果发现样品中沙门氏菌检出率为5.36%（45/840）[7]；而韩依辛等调查结果显示广东省部分屠宰生猪沙门氏菌检出率达14.06%（70/498）[6]。

为初步调查屠宰场生猪沙门氏菌污染情况及分离菌对不同抗生素的耐药特性，本试验于2020年5—8月从湘潭县3个屠宰场采集屠宰猪组织及环境样品共90份，用于沙门氏菌分离鉴定，结果发现共9份样品为沙门氏菌阳性，平均检出率为10%，其中猪肉样品和环境样品检出率分别为6.9%和15.6%，且以上3个屠宰场中均有沙门氏菌阳性样品，这些数据说明湘潭县生猪屠宰场中猪肉或环境中存在沙门氏菌污染，且环境污染更加严重，同时也提示屠宰场应定期对环境和屠宰工具等进行消毒，防止环境中致病菌污染猪肉。

进一步药敏试验分析结果显示，本试验分离的9个沙门氏菌分离株对不同抗生素耐药性存在差异，其中对多环西素、头孢唑林、林可霉素和克林霉素耐药率均超过80%，提示临床上不能使用以上抗生素用于该地区猪沙门氏菌病防控；但以上菌株对氧氟沙星、恩诺沙星和多黏菌素B等耐药率相对较低，提示以上抗生素是防控猪沙门氏菌病的首选，但不可长期使用同种药物，应注意穿梭用药。