副猪嗜血杆菌实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，王 艳，苗立中，李 峰

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis, HPS）属于巴斯德杆菌科（Pasteurellaceae）嗜血杆菌属家族成员，是定植于猪上呼吸道的一种共栖菌[1]，也是一种条件性致病菌，在猪只免疫力低下或受到应激时会引起副猪嗜血杆菌病（又称为格拉泽氏病，Glasser's disease）。该病在全球范围内广泛流行，常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、胸膜炎和脑膜炎等。主要影响2周龄到4月龄的青年猪，死亡率较高，是当前我国养猪业的重要细菌性疾病之一，常与病毒性疾病、免疫抑制性疾病发生混合感染，给养猪业造成较大的经济损失[2]。目前HPS有15个血清型，不同血清型菌株之间存在强毒力、中等毒力和无毒力等显著差异，且各血清型之间交叉保护力弱，疫苗的免疫效果较差，从而加重了副猪嗜血杆菌病的流行[3]。另外，HPS常与其他细菌或病毒混合感染，给兽医临床诊断也带来了困难。因此，迫切需要建立HPS的快速检测技术。本文简要概述了副猪嗜血杆菌的最新实验室检测技术研究进展，以期为HPS的早期快速检测、流行病学调查和有效防控提供参考。

1 细菌分离与鉴定

HPS是一种多形态、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖型、不运动的革兰氏阴性短小杆菌。对HPS的分离培养和生化鉴定是HPS诊断的金标准。然而该菌的分离培养较为困难，对病料、采集时间、培养基等都有较高的要求。一般应选取临床症状典型且未经抗生素治疗的病猪，无菌条件下采集病猪肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结、关节液、心包液和脑脊液等组织新鲜病料，接种于含1.5%NAD和5%血清的巧克力琼脂培养基或TSA等培养基上进行培养[4]，37 ℃培养24～48 h后，可以观察到针尖大小、圆形、光滑湿润、灰白色半透明或无色透明、边缘整齐的露珠样小菌落。挑取单个菌落涂片后进行革兰氏染色，显微镜下观察可见革兰氏阴性短小杆菌。葡萄球菌可产生V因子，需V因子的HPS可在其周围生长呈“卫星现象”。挑取单个菌落水平划线接种于不含NAD的绵羊鲜血平板上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37 ℃培养24～48 h后，观察其在葡萄球菌周围生长情况，应出现“卫星生长现象”且无溶血现象。对分离到的疑似菌株还必须进行生化试验鉴定，HPS可分解蔗糖和尿素，不分解乳糖、甘露醇和麦芽糖，对葡萄糖发酵不稳定，醋酸铅试验呈阴性，硝酸盐还原试验呈阳性。尹秀凤等（2004）[5]率先开展了HPS的分离与鉴定。细菌分离鉴定特异性较强，但操作复杂，费时费力，无法满足临床大量样本快速检测的要求。

2 血清学方法

2.1 补体结合试验（CF）

Takahashi等（2001）[6]用CF试验来评价以HPS血清2型和血清5型为抗原的二价疫苗免疫后的效果，在二次接种19 d后检测阳性抗体效价，证实该方法敏感、特异，但是没有评价交叉反应。CF的参与成分多、影响因素复杂，虽然HPS在疾病过后特异性抗体效价被识别，但是不同的血清型之间有广泛的交叉反应，无法区分待检HPS血清型。

2.2 间接血凝试验（IHA）

魏子贡等（2006）[7]将HPS血清4型和血清5型分离菌株经超声波破碎处理后的产物致敏醛化绵羊红细胞建立IHA方法。应用该方法对免疫猪群的抗体水平进行检测，免疫猪群两周后抗体检出率达89%。其敏感性为琼脂扩散试验（AGP）的16倍。石碧等（2007）[8]提取了HPS血清5型菌株的荚膜多糖（CPS），并以之为抗原建立了IHA方法，通过优化CPS产生的最适体外培养条件，得到了高质量的抗原，从而使抗体检测的敏感性得到了大幅提高。徐引弟等（2011）[9]选用HPS的血清4型、5型和13型3种血清型为抗原建立了IHA方法。IHA虽有较高的敏感性，但特异性不太强，而且操作步骤繁琐、稳定性差，阻碍了其在HPS临床检测上的推广应用。

2.3 平板凝集试验（PAT）

高艳等（2015）[10]利用副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制备血清抗体，建立HPS的平板凝集试验检测方法，并用此方法对陕西部分地区猪场的猪进行了HPS血清抗体检测，其检测结果与临床诊断结果基本一致。PAT方法具有简便、快速、经济、准确等优点，常用于评估HPS疫苗免疫的抗体水平，但该法只能做定性检测，且易受检疫现场环境因素影响而出现非特异性反应，因此仅适用于集约化猪场和散养猪HPS的现场检疫或初步筛查。

2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA既可以检测抗原，也可以检测抗体，具有简便、快速、特异性强、敏感性高等优点，可同时检测大量样品，适用于副猪嗜血杆菌病的血清抗体检测和血清流行病学调查。建立该方法所选择的包被抗原有灭活全菌体、荚膜多糖、超声破碎抗原等。王艳等（2006）[11]选用甲醛灭活的全菌体作为包被抗原建立了检测HPS抗体的间接ELISA方法，具有较好的试验效果。全菌体抗原制备简便，但存在成分复杂、抗原释放不全等因素。采用全菌体抗原的阴性本底略微偏高，检测结果不太稳定并且经常出现假阴性。石碧等（2007）[8]以HPS血清5型菌株的荚膜多糖作为抗原建立了间接ELISA检测方法，敏感性是IHA的5～10倍。刘娜（2008）[12]分别以HPS全菌体抗原和超声波破碎抗原作为包被抗原建立两种间接ELISA方法，经对四川省和重庆市的4个猪场的162份血清进行检测，其结果与IHA的符合率分别为98.15%和97.53%。郑念广等（2011）[13]将121 ℃高温高压处理HPS血清4型和血清5型耐热蛋白混合作为包被抗原，建立了检测HPS抗体的间接ELISA方法。冯小明等（2009）[14]、马福利等（2015）[15]先后将HPS血清5型分离株菌体超声裂解，取上清液作ELISA包被抗原，建立了HPS抗体间接ELISA方法，可用于副猪嗜血杆菌病的检疫和流行病学调查。

鉴于全菌体抗原成分复杂，可能会影响检测结果的稳定性，同时存在散毒危害。超声波破碎后的HPS菌体上清液抗原成分尽管没有全菌体复杂，但并不单一。为消除无关抗原给间接ELISA方法的抗体检测结果带来不准确性，研究人员选用抗原成分单一且安全性较好的HPS蛋白作为包被抗原。故近年来，国内有使用外膜蛋白（OmpP2、OmpP5、OmpP16）、寡肽通透酶蛋白（OppA）和HPS细胞致死膨胀毒素（CDT）等大肠杆菌表达的蛋白作为包被抗原建立的ELISA检测方法。外膜蛋白OMP是HPS的主要毒力因子之一，是检测HPS的候选抗原。李鹏等（2011）[16]、贾爱卿等（2011）[17]、李淼等（2011）[18]分别以HPS的重组OmpP2作为包被抗原建立间接ELISA方法，成功用于临床HPS抗体的检测。陈善真等（2011）[19]、臧莹安等（2012）[20]分别利用表达纯化的HPS的OmpP5作为包被抗原，建立了检测HPS抗体的间接ELISA方法。宋帅等（2016）[21]以OmpP5的特异性单克隆抗体作为捕获抗体、HPS的兔多克隆抗体作为检测抗体，建立了检测HPS抗原的双抗体夹心ELISA检测方法，可对临床样品进行快速、准确的检测。郑新添等（2018）[22]以HPS外膜蛋白OmpP16为包被抗原建立了检测HPS抗体的间接ELISA方法。车勇良等（2013）[23]利用HPS重组OppA建立的间接ELISA抗体检测方法，具有良好的特异性和稳定性。尽管HPS具有多种血清型，但是所有血清型均能合成CDT，该毒素包括3个亚基CdtA、CdtB和CdtC。刘双红等（2016）[24]以CdtB为包被抗原，石保秋（2019）[25]以CdtC为包被抗原，分别建立了检测HPS抗体的间接ELISA方法，均获得较好的临床检测效果。王雷（2011）[26]将OmpP5、CdtA、CdtB、CdtC 4种蛋白混合作为包被抗原，以此建立的间接ELISA方法与全菌体抗原包被的间接ELISA方法之间，抗体检测结果无显著差异。应用上述蛋白建立的ELISA方法均优于全菌体抗原作为包被抗原建立的方法，然而胸膜肺炎放线杆菌有与外膜蛋白OmpP2同源的蛋白（42%～71%氨基酸一致性），大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌和耶尔森菌等都有与的OppA同源的蛋白（55%～57%氨基酸一致性），大肠杆菌有与HPS的CdtB结构和功能相似的同源蛋白（44%氨基酸一致性）。其它适用于包被抗原的HPS蛋白也相继被报道。朱晓明等（2015）[27]以锰依赖的超氧化物歧化酶（MSD）作为包被抗原，建立了HPS间接ELISA检测方法，但该方法只能保证对HPS的4、5和12血清型进行准确检测。王正皓（2018）[28]以YfeA蛋白为包被抗原，刘俊琦（2020）[29]以Neu蛋白为包被抗原，刘晓露等（2021）[30]以重组表达的HPS转铁结合蛋白A（TbpA）为包被抗原，分别建立了检测HPS抗体间接ELISA方法，其临床应用效果优于全菌体抗原包被建立的间接ELISA抗体检测方法。黏附素蛋白（Apd）为HPS所特有的一种位于细菌表面的蛋白，在HPS的15个血清型菌株和不能分型菌株中都含有该蛋白，而在其他相关猪的细菌性病原中没有同源或类似蛋白。田杨等（2020）[31]建立了针对Apd蛋白的ELISA抗体检测方法，用于HPS灭活疫苗免疫后的抗体检测和HPS疾病的血清检测。采用HPS具有高度保守性的主要结构性功能蛋白用于建立间接ELISA抗体检测方法，不仅成分单一，避免无关抗原干扰结果的稳定性，而且安全性好，不存在散毒的危险，可成为理想中的包被抗原。

2.5 免疫组化（IHC）

Amano等（1997）[32]利用IHC方法在福尔马林固定、石蜡包埋的组织中检测到了HPS抗原。IHC方法能够在HPS受感染组织中直观地展现出细菌抗原的存在，但因该方法所使用的多克隆抗体会与其他细菌如猪胸膜肺炎放线杆菌等产生交叉反应，而在临床诊断HPS感染时存在一定的局限性。

3 分子生物学方法

3.1 PCR

PCR技术具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，同时克服了培养困难、血清学检测易发生交叉反应的缺点，已被广泛应用于HPS病原体的检测。林雪玲等（2006）[33]建立的PCR方法不仅可从初代分离培养物中对HPS进行鉴定和感染确诊，而且可以直接对病料进行PCR检测。米丰泉等（2005）[34]在已经建立的猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）、猪多杀性巴氏杆菌（PM）、HPS的单项PCR方法的基础上，成功地建立了APP、PM、HPS的复合PCR方法，对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。目前已经建立的HPS分子生物学检测方法主要针对16S rRNA、infB、OmpP2、PILA、LIPO等基因，其中16S rRNA、infB是最常用的检测靶标基因。16S rRNA基因在细菌各种属之间具有高度保守性，被广泛用于细菌之间的种属鉴定。周勇岐等（2007）[35]、张盼锋等（2009）[36]、万世平等（2009）[37]、刘建奎等（2012）[38]、马超锋等（2017）[39]先后根据HPS的16S rRNA基因为模板设计引物，建立了PCR检测方法，可用于临床快速检测HPS。李鹏等（2010）[40]针对HPS的OmpP2基因设计引物建立PCR方法，敏感性达到了1 000个HPS。吴静波等（2016）[41]根据HPS的P2蛋白基因和猪鼻支原体（Mhr）的P37蛋白基因分别设计了1对引物，建立HPS和Mhr双重PCR检测方法，检测灵敏度可达到100 copies，实现了HPS和Mhr的同时、快速、准确诊断，有利于疾病的后续治疗和疫情的控制，为HPS和Mhr的准确诊断和有效防控了提供有力的技术支持。梁乔等（2018）[42]根据HPS的转录起始因子infB基因设计引物建立PCR方法，能检测到的最低DNA浓度为18.1×10-6μg/mL。PILA和LIPO是HPS的外毒素基因。朱新贵等（2018）[43]根据HPS的16S rRNA、PILA、LIPO基因保守序列和的16S rRNA、KMT1基因保守序列，同时建立了双重及多重PCR方法，可用于HPS和PM的临床快速诊断。

3.2 荧光定量PCR

荧光定量PCR技术比PCR具有更高的检测特异性与敏感性，而且具有定量准确、全封闭反应等优点，已被广泛用于动物疫病检测。于江等（2010）[44]、苗立中等（2012）[45]先后根据infB基因序列建立了检测HPS的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，敏感性是常规PCR的100倍。罗宝正等（2011）[46]根据infB基因序列，建立了TaqMan探针荧光定量PCR方法，与细菌分离方法的检测效果一致。李军等（2011）[47]根据16S rRNA基因序列建立了快速定量检测HPS的实时荧光定量PCR方法，检测的最低限度是50 copies/μL。张林海（2012）[48]、崔沛等（2018）[49]先后根据HPS 16S rRNA基因序列设计引物和TaqMan-MGB荧光探针，建立了HPS的荧光定量PCR检测方法。灵敏度可达1.98×101copies/μL。李富祥等（2013）[50]根据HPS的16S rRNA基因建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其灵敏度为6.92×101copies/μL，可用于HPS感染的早期快速检测、定量分析以及流行病学调查。姜睿姣等（2019）[51]根据HPS的OmpP2基因序列和PM的PlpE基因序列分别设计了特异性引物和探针，建立了一种能同时检测HPS和PM的双重荧光定量PCR方法。荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好、耗时短，使得其在临床应用上能够在较短的时间排查病原，具有较大的应用价值。

3.3 数字PCR

数字PCR是近十年来兴起的第3代PCR技术，该方法采用直接计数目标分子数而不依赖任何校准物或外标，通过计数单个分子从而实现绝对定量。与实时荧光定量PCR技术相比，数字PCR技术具有精准、灵敏度超高和不易受PCR抑制物影响等优点。数字PCR的建立为HPS检测和流行病学调查提供了新的方法和借鉴。石磊等（2018）[52]根据HPS的OmpP2基因设计引物和TaqMan探针，建立了可对其准确定量的微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）检测方法，并与荧光定量PCR检测方法进行了比较分析。结果表明ddPCR具有敏感性高、特异性好等优点，最低可检测到2.647 copies/μL的阳性质粒，灵敏度和实际检出率均高于荧光定量PCR，可用于HPS低含量样品检测和定量检测。数字PCR技术也存在一些不足，如检测所需时间较长，是荧光定量PCR的2～3倍；检测样本需要稀释到一定浓度才可检测；单个样本检测成本高于荧光定量PCR，所需仪器设备昂贵等。

3.4 环介导等温扩增（LAMP）技术

LAMP技术是一种核酸等温扩增技术，具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，非常适合基层的临床检测和进出口岸的通关检测。朱杰仪等（2010）[53]、吴诗敏等（2010）[54]、侯魁等（2017）[55]、刘亚娟等（2018）[56]、李璐璐等（2020）[57]先后根据HPS的16S rRNA基因设计引物，建立了LAMP方法，检测灵敏度是常规PCR的100倍以上。魏晓媛（2013）[58]根据OmpP2基因建立了LAMP方法，其最低检测DNA量为0.2 pg/μL。车勇良等（2013）[23]根据HPS肽聚糖相关脂蛋白（PalA）基因序列设计引物，在反应后的体系中加入SYBR Green I，建立了可视化LAMP检测方法。整个反应只需要在55 ℃水浴1 h即可，反应结束后只需向反应液中加入荧光染料，通过肉眼就能辨别检测结果。Zhang等（2012）[59]根据infB基因建立了HPS的LAMP方法，检测限为10 CFU/mL。Gou等（2018）[60]根据HPS的wzs5基因建立的交叉引物扩增核酸试纸条检测方法，60 ℃恒温反应1 h，即可通过带有垂直流可视化的反应条带，可对14 CFU/mL以上的HPS进行检测。刘博婷等（2018）[61]根据HPS的infB基因和猪链球菌2型（SS2）的Cps2j基因各设计1套LAMP引物，建立了HPS与SS2的双重LAMP检测方法，可实现两种病原的同步快速检测。李忍等（2021）[62]根据HPS血清4型脂多糖合成蛋白基因wcip4和血清13型糖脂转移蛋白基因gltP序列设计引物，分别建立了快速鉴定HPS血清4型和血清13型的LAMP方法，基因组DNA检测限分别为1 pg/μL和2.5 pg/μL。到目前为止，LAMP技术与PCR方法相比，成本低廉，不需要昂贵的仪器设备，是检测HPS所需时间最短的一种检测方法，但在实际操作中，由于其灵敏度高，以致开盖后容易造成气溶胶污染而出现假阳性的结果。而且由于LAMP的结果主要通过肉眼对液体的浊度和荧光亮度进行判定，存在一定的主观性，不利于可疑样品的精确判断。

3.5 原位杂交（ISH）

Jung等（2004）[63]研发了ISH方法，应用该方法检测了HPS的基因组序列。ISH优点高于IHC，能够直接展示出HPS与组织损伤之间的关系，能避免特异性抗体有效性的问题。然而，HPS的16S rRNA基因探针与猪胸膜肺炎放线杆菌极为相似，在检测时可能有交叉反应。而且ISH技术要求高，且需要特定的设备，价格昂贵，不适用于开展大规模的流行病学调查和快速诊断。

4 小结

随着我国养猪业的快速发展，副猪嗜血杆菌病的流行越来越广泛，已经成为呼吸道病综合征中的重要疾病，对猪的危害日趋严重。该病防控的关键在于及时确诊并采取相应的防治措施。根据该病的流行病学特点、主要临床症状及解剖病变作出初步诊断后再结合实验室检测技术，可对该病确诊。另外，快速敏感的检测技术不仅对于及时采取措施防控疫情蔓延等至关重要，还能及早发现新菌株、最终菌株的演化，找出最危险的病原菌并开发相关疫苗，在防控疫情时掌握主动。上述HPS的实验室检测方法多种多样，技术在不断的革新和完善，但是每种方法均具有各自的优缺点和实用性，在实际应用中应根据具体情况选择适宜的方法。相信随着分子生物学技术的不断发展，HPS的检测会向着更加敏感、特异、快速、简便、高效的方向发展，并在综合防控与净化中发挥重要作用，从而达到根除疾病的目的。