网络药理学探索雷公藤治疗口腔扁平苔藓的药理特性和治疗机制

吴泽钰，赵今，王琛，龚怡，薛瑞

1.新疆医科大学第一附属医院（附属口腔医院）牙体牙髓病科，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐（830054）；2.新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐（830054）；3.新疆医科大学第一附属医院（附属口腔医院）口腔黏膜中西医结合科，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐（830054）

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜疾病中一种常见的慢性炎性疾病，WHO将其列入癌前状态的范畴。其病因不明确，可能与免疫因素［1］、感染因素、内分泌因素等有关，所以其治疗也多以免疫抑制剂为主［2］，如糖皮质激素、羟氯喹［3］等。研究发现，卫矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）有很强的抗炎作用，可抑制体液免疫，同时对细胞免疫有双向调节作用，口服雷公藤总苷片是一种有效的OLP治疗方法［4］。然而雷公藤的毒副作用大［5］、药效成分和作用机制不明确又使许多医师及患者望而却步。因此探寻雷公藤治疗OLP的主要成分及其作用机制为雷公藤制剂应用于临床的必经之路。

近年来，研究发现人类疾病的复杂程度远比最初预想的要复杂得多，它们往往是由多个分子异常引起的，而不是由单一缺陷引起。利用网络药理学，可以在靶蛋白、生物功能和生物活性物质的基础上形成复杂的相互作用网络，能够在分子水平上从系统的角度阐明中药的作用机理，成为中药研究的一种新方法。该方法已被应用于指导和协助药物重新定位，发挥治疗作用的药物可以直接作用于疾病相关蛋白，也可以调节病理过程中涉及的通路［6］。本研究运用网络药理学的思路和方法筛选雷公藤治疗OLP活性成分，探寻其作用靶点，以经济有效的方式从计算生物信息学角度阐明雷公藤治疗OLP的药效物质基础，以期为雷公藤治疗OLP的机制探究及临床应用提供理论依据和药效保障。

1 资料和方法

1.1 筛选雷公藤活性组分和靶点

在中药系统药理学数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中药综合数据库（Traditional Chinese Medicine integrated database，TCMID）中检索“雷公藤”，得到雷公藤的成分及作用靶点。利用PubChem和ChemBL确定成分的三维结构，建立雷公藤组分数据库。

1.1.1 雷公藤活性组分的筛选 本研究筛选口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物类药性（drug likeness，DL）≥0.18，及该活性化合物在雷公藤中的占比，及OLP防治潜力作为筛选条件。

1.1.2 OLP靶点基因的筛选 通过在Gene Cards、DisGeNET、DrugBank和OMIM中输入“oral lichen planus”等关键词等搜索相关基因，得到的疾病靶点与雷公藤治疗靶点筛选出共同靶点，作为雷公藤治疗OLP的潜在靶点。

1.2 化学成分-靶点网络构建与分析

利用Cytoscape 3.7.2软件将雷公藤筛选出的化学成分、治疗靶点导入，构建“化学成分-靶点”网络，分析拓扑属性，节点越多，度值越大，节点的中介中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）以及拓扑系数（topological coefficient，TC）等信息通过该软件分析计算得出［7］，筛选网络拓扑中的关键药物成分，分析主要作用靶点及潜在作用机制。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络

在STRING 11.0［8］数据库中会对每个蛋白质的相互作用信息打分，其分值越高蛋白质的互作置信度越高。输入靶点，得到分值>0.4的高置信度蛋白相作数据，构建PPI网络，利用Network Analyzer分析拓扑属性。

1.4 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

使用Cluster Profiler软件包［9］，找出显著富集的生物学注释，对靶点进行GO富集分析及KEGG富集分析，筛选P<0.01，结果利用R 3.6.1可视化。

1.5 雷公藤化学成分-靶点-通路网络的构建

将代谢通路信息、核心靶点和雷公藤活性成分导入Cytoscape3.7.2中，利用“Merge”功能将其融合，构建“雷公藤化学成分-靶点-通路”网络图。

2 结果

2.1 雷公藤活性组分的筛选

中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）、中医药综合数据库（TCMID）获得雷公藤活性组分51个，根据筛选条件共筛选出活性组分23个，详见表1。

表1 雷公藤主要活性组分及药理参数Table 1 The main active components and pharmacological parameters of Tripterygium wilfordii

2.2 雷公藤和OLP相关靶点

雷公藤的23个活性组分在TCMSP、TCMID数据库中获得去重后靶点150个。通过GeneCards、DisGeNET、DrugBank和OMIM数据库得到去重后靶点472个。药物作用靶点与疾病靶点韦恩分析，得到44个雷公藤治疗OLP的潜在靶点（图1、表2）。

2.3 构建与分析化合成分-靶点网络

如图2所示，雷公藤化学成分-靶点网络运用Cytoscape 3.7.2软件构建。

Figure 1 Venn diagram图1 韦恩图

表2 雷公藤治疗OLP的潜在活性成分及作用靶标Table 2 Potential active ingredients and targets of Tripterygium wilfordii in the OLPtreatment

图中有69个节点（23个化学成分，44个目标）和320个边。网络拓扑分析表明，平均度数为4.64，说明雷公藤多靶点治疗OLP具有多靶点特性，其拓扑学参数见表3。同时，可以看出雷公藤中发挥主要作用的成分雷公藤内酯、山奈酚、川陈皮素等。许多靶点与多种成分相关，这表明雷公藤发挥药效过程中，不同成分之间存在的协同作用。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

STRING数据库获得44个靶点的PPI网络，共44个节点和214个边缘，网络的平均度值为10.4（图3a）。节点反映网络中连接“度”的大小，按照度值降序排序筛选出核心靶蛋白30个，其中以边缘数排序前10位的有：肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、转 录 因 子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、白细胞介素4（interleukin 4，IL4）、白细胞介素8（interleukin 8/C-X-C motif chemokine ligand 8，IL8/CXCL8）、细胞间黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1）、转录因子p65（Transcription factor p65，RELA）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、γ干扰素（interferon gamma，IFNG）（图3b、表4）。

Figure 2 Tripterygium wilfordii chemical components-targets network diagram图2 雷公藤化合成分-靶点网络拓扑学参数

2.5 GO和KEGG富集分析

对上述44个靶点进行GO富集分析，根据P<0.01确定了63个GO条目（表5）。

雷公藤治疗OLP的潜在靶点GO富集分析结果如表5所示，生物过程（biological process，BP）相关条目19个，涉及白细胞分化、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应等方面（图4）；分子功能（molecular function，MF）相关条目33个，涉及细胞因子受体结合、蛋白质异构化活性、血红素结合等方面（图5）；细胞成分（cellular component，CC）相关条目11个，涉及膜筏、膜微结构域、膜区等方面（图6）。

KEGG分析得到111条信号通路，根据P<0.01筛选出66条通路，绘制气泡图（表6、图7）。包括IL17信号通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、TNF信号通路、肺结核、美洲锥虫病、Toll样受体信号通路等通路。

2.6 雷公藤化学成分-靶点-通路网络

由Cytoscape3.7.2的“Merge”功能构建的“雷公藤化学成分-靶点-通路”网络图，存在83个节点，584条边缘，平均“度”值为7.06。由图8可见KEGG富集到的前16个信号通路、44个核心靶点、23个活性成分间关系密切。这可能说明雷公藤中的多种化合物可以通过多个靶点调节多条信号通路来达到潜在治疗OLP的作用。

表3 雷公藤化学成分的拓扑学参数分析Table 3 Topological parameter analysis of Tripterygium wilfordii chemical component

Figure 3 Active components of the Tripterygium wilfordii treated OLPprotein-protein interaction图3 雷公藤活性组分治疗OLP的蛋白质-蛋白质相互作用

表4 雷公藤治疗OLP核心靶点的拓扑学参数分析Table 4 Analysis of the topological parameters of the core target of Tripterygium wilfordii in the OLPtreatment

表5 雷公藤治疗OLP的潜在靶点GO富集分析结果（各前10条）Table 5 GOenrichment analysis results of potential targets of Tripterygium wilfordii for the OLPtreatment(top ten of each items)

Figure 4 Enrichment and analysis of GO biological processes in potential targets of T ripterygium wilfordii for the OLP treatment图4 雷公藤治疗OLP潜在靶点的GO生物学过程富集分析

Figure 5 Enrichment and analysis of GO molecular functions in potential targets of Tripterygium wilfordii for the OLP treatment图5 雷公藤治疗OLP潜在靶点的GO分子功能富集分析

Figure 6 Enrichment and analysis of GOcellular components in potential targets of Tripterygium wilfordii for the OLPtreatment图6 雷公藤治疗OLP潜在靶点的GO细胞成分富集分析

表6 雷公藤治疗OLP的潜在靶点KEGG富集分析（前10条）Table 6 KEGGenrichment analysis results of potential targets of Tripterygium wilfordii for OLPtreatment(top 10 of each)

Figure 7 KEGG enrichment analysis of potential targets of Tripterygium wilfordii for the OLPtreatment图7 雷公藤治疗OLP潜在靶点的KEGG富集分析

Figure 8 Tripterygium wilfordii chemical component-target-pathway network diagram图8 雷公藤化学成分-靶点-通路网络

3 讨论

雷公藤作为中药，在我国有悠久的应用历史，现代医学也证实雷公藤及其制剂有广泛的药理学作用，对慢性荨麻疹、类风湿性关节炎等难治的自身免疫性疾病有较好疗效；对各类肿瘤如乳腺癌、胰腺癌均有显著疗效，并有保护神经的作用，被用于治疗阿尔兹海默症、帕金森综合征等疾病［10］。OLP是临床发病率仅次于复发性阿弗他口腔溃疡的口腔黏膜及皮肤慢性疾病，并且属于口腔黏膜潜在恶性疾患，其发病机制不明，可能与精神、免疫、感染等多因素相关。OLP上皮固有层内有大量以T淋巴细胞为主的淋巴细胞呈密集带状浸润，无论在病损早期、后期均有T细胞介导的细胞免疫反应存在［2］。

本研究运用网络药理学方法构建“雷公藤化学成分-靶点-通路”的作用网络，系统分析雷公藤的化学成分多通路、多靶点治疗OLP的潜在机制。最终得到23个活性组分和44个潜在靶标。在PPI网络中，TNF、AKT1、JUN、TP53、IL4、CXCL8、ICAM1、RELA、VEGFA、IFN-γ等蛋白靶点与雷公藤活性成分及OLP相关性更高，它们可能是雷公藤调控OLP网络的潜在核心调控因子。

本研究结果中的调控网络显示雷公藤内酯、山奈酚等匹配多个靶点，是雷公藤治疗OLP的主要成分。雷公藤内酯对炎症、纤维化、癌症、病毒感染、氧化应激和骨质疏松症具有强大的药理活性［10］。Wang等［11］证明在类风湿性关节炎模型小鼠中，雷公藤内酯可通过降低TNF-α水平，促进破骨细胞前体细胞凋亡，并且其肝毒性小于甲氨蝶呤，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3，CASP3）是TNF信号通路的下游分子，位于细胞凋亡途径的关键节点，在暴露于雷公藤内酯的终末分化肝细胞活力显著下降，CASP3的活性形式增加，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡［12］；雷公藤内酯通过激活抑癌基因p53，抑制肝癌细胞活力，诱导细胞凋亡［13］。这也与本研究所富集到的靶点及通路一致，也说明雷公藤可能通过细胞凋亡途径、TNF信号通路等多通路共同调控以上靶蛋白，对细胞免疫进行调控，发挥其抗炎抗癌作用，从而对OLP产生治疗作用，但仍需进一步的体内、外研究证实。

KEGG富集分析中IL17信号通路占有很大的基因比例。不同种类的IL17可激活CASP3，诱导细胞凋亡。研究表明雷公藤内酯可导致辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）与调节性T细胞（Regulatory cells，Tregs）比例失衡，Th17细胞扩增增强，Tregs产生抑制，特别是辅助Th17细胞分泌的IL17显著增加［14］。贾沛茹等［15］检测到OLP患者外周血中Th17和Treg细胞比率增加，Th17/Treg平衡被打破，这种平衡紊乱的结果与临床上OLP患者病情的严重程度有关。IFN-γ水平上调，IL4水平下调，细胞免疫增强，这是OLP的易患因素［2］，IL4作为辅助型T细胞2（T helper 2 cell，Th2）分泌的细胞因子，可抑制Th17的应答［16］。本研究结果与其具有一致性，说明雷公藤内酯调节IL17信号通路可能为其治疗OLP的一个方式。但在OLP的治疗中雷公藤内酯的作用还有待进一步研究证明。

在癌细胞的增殖过程中，有氧代谢有着非常重要的地位，山奈酚通过直接作用于抗氧化酶，作为一种抗氧化剂清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生发挥抗氧化作用［17］，并且其对未突变的细胞具有保护作用，而在突变的细胞中则会触发细胞凋亡［18］，这对治疗属于口腔黏膜潜在恶性疾患的OLP有很大意义，但鲜有研究阐述其肝、肾等毒性，仍需进一步研究证明。

综上所述，本研究应用网络药理学方法初步揭示雷公藤治疗OLP的主要成分、作用靶点和作用途径，为将来从雷公藤中开发出高活性、低毒性的治疗OLP的药物的深入研究提供了理论依据，但仍需进一步的科学验证。

【Author contributions】 Wu ZY，Wang C，Gong Y analyzed the data and wrote the article，Zhao J，Xue R revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.