能力验证乳粉样品中 双歧杆菌计数培养基的选择探究

劳嘉倩，蒋佳希，尹玮璐

（广州市食品检验所，广东广州 510410）

双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类严格厌氧的革兰氏阳性杆菌，广泛存在于人和动物体内，具有抗菌、抗感染、免疫调节、降低胆固醇、抗肿瘤等多种生理功能[1-4]，是人体内重要的益生菌。目前，双歧杆菌在医学、功能性食品、保健食品等方面有较深入的研究，被广泛应用于各种乳制品中。

随着食品行业的快速发展，消费者对食品的安全性和质量要求越来越高，我国食品微生物标准《食品安全国家标准 婴儿配方食品》（GB 10765—2010）和《食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品》（GB 10767—2010）中明确规定添加活性菌种的产品其活性益生菌的数量要≥ 106CFU/mL，但要准确测定食品中双歧杆菌的含量，通常受测试环境、样品保存条件、样品均匀性、稀释体积、取样体积、培养时间、培养温度、观察计数等多方面因素的影响[4-8]。因此，科学、准确地测定产品中双歧杆菌等益生菌的数量十分关键。

能力验证是利用实验室间的比对判定实验室的特定校准、检测能力，以考察实验室检验技术能力的外部质量活动[9-10]，在人员能力评估、数据准确性分析等方面具有重要意义[11-13]。为了更准确更科学全面的得出能力验证结果，本实验室依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》（GB 4789.34—2016），采用人员比对及MRS琼脂和双歧杆菌琼脂（BBL培养基）2种培养基对能力验证样品进行检测，通过比较分析不同培养基对双歧杆菌计算结果的差异，探究不同培养基的适用性，为实验室进行双歧杆菌计数培养提供培养基的选择参考。

1 材料与方法

1.1 样品

样品20-U983和20-Z259来源于中国检验检疫科学研究院测试评价中心。

1.2 仪器与试剂

Dilumat STRT重量稀释仪（法国biomerieux公司）；Ⅱ级A2型生物安全柜（美国Thermo公司）；Anoxomat Ⅲ 智能化厌氧系统（荷兰anoxomat公司）；IF450 生化培养箱（德国memmert公司）；MRS培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；双歧杆菌培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；0.85%生理盐水（实验室自制）；西红柿浸出液（实验室自制）。

1.3 实验方法

本研究参照ACAS-PT926(2020)乳粉中乳酸菌检验能力验证参试指导书、GB 4789.34—2016方法操作，制备10倍系列稀释样品匀液至10-5。样品称量前要充分混匀，确保乳酸菌在样品中分布均匀。稀释过程中应充分均质拍打1～2 min， 10倍系列稀释管注意要用旋涡振荡器混匀。在进行10倍递增稀释的同时，吸取10-3～10-5样品匀液1 mL于无菌平皿内，做2个平行平皿。及时将10～20 mL冷却至46～50 ℃ 的琼脂培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀，于（36±1） ℃ 下厌氧培养48 h，计数平板上的所有菌落数。样品制备到平板倾注要求在15 min内完成。

分别选择BBL培养基和MRS培养基及3名检测员进行比对实验。

1.4 分析方法

实验结果采用重复性限、再现性限[14]进行分析。重复性为同一样品使用同一培养基，由同一操作者在短时间内进行的两次平行试验的结果，取以10为底的对数后，绝对值差值≤0.25（即重复性限，r=0.25）。再现性为同一样品使用不同培养基进行计数，同一操作者2次独立试验结果取以10为底的对数后，绝对值差值≤0.45（即再现性限，r=0.45）。人员比对再现性：同一样品使用同一培养基进行计数，由不同操作者进行的2次独立试验结果取以10为底的对数后，绝对值差值不大于0.45（即再现性限，r=0.45）。

2 结果与分析

样品使用BBL培养基和MRS培养基经（36±1）℃厌氧培养48 h后，双歧杆菌数计数结果及计算见表1。

表1 不同琼脂平板上的菌落计数结果

人员1的重复性分别为：r=0.11，r=0.08，r=0.01，r=0.06； 人员2的重复性分别为：r=0.06，r=0.10，r=0.04，r=0.04，人员3的重复性分别为：r=0.13，r=0.09，r=0.04，r=0.02，均低于重复性限（r=0.25），重复性均较好。

样品Z259使用MRS培养基做人员比对，其再现性r=0.10，r=0.05，r=0.05；使用BBL培养基做人员比对，其再现性r=0，r=0.02，r=0.02。样品U983使用MRS培养基作人员比对，其再现性均为r=0.01，使用BBL培养基作人员比对，其再现性均为r=0。以上人员比对的再现性均低于再现性限r=0.45，表明两种培养基的稳定性均较好。最终选取人员1的计数结果进行分析及报告。

样品Z259取稀释度10-4进行菌落计数，在MRS培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为 2.3×105CFU/g。在BBL培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为3.4×105CFU/g。样品Z259在BBL培养基上的菌落计数和在MRS培养基上的菌落计数的再现性r=0.17，小于再现性限（r=0.45），同一样品在2种培养基的计数结果之间的差值不明显。

样品U983取稀释度10-4进行菌落计数，在MRS培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为7.4×105CFU/g。 在BBL培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为1.2×106CFU/g。样品U983在BBL培养基上的菌落计数和在MRS培养基上的菌落计数的再现性r=0.21，小于再现性限（r=0.45），表明2种培养基对同一样品的计数结果之间的差值是可以接受的。

3 结论与讨论

（1）本次能力验证乳粉样品中仅含有双歧杆菌，按照GB 4789.34—2016的标准要求对样品中双歧杆菌进行计数。本次能力验证为实验室间评定，因MRS培养基和BBL培养基的菌落计数差异不大，考虑到BBL培养基配制烦琐，多数实验室更倾向于使用较为便捷的MRS培养基，故本次结果报告取MRS培养基的菌落计数，20-Z259结果报告为2.3×105CFU/g，20-U983结果报告为7.4×105CFU/g,|Z|值均小于2，结果均反馈为满意结果。

（2）实验所用的BBL培养基和MRS培养基均以蛋白胨作为氮源，葡萄糖或可溶性淀粉作为碳源，酵母提取物作为生长因子[15]。相同培养条件下，BBL培养基上的菌落数较MRS培养基多，可能是因为BBL培养基中含有半胱氨酸盐，能为双歧杆菌的生长提供更适宜的还原性环境（厌氧环境），BBL培养基额外添加了番茄汁作为天然营养物质，新鲜番茄汁富含多种维生素，能作为促进双歧杆菌生长的双歧增殖因子，提高双歧杆菌的生长活力[16-17]。研究表明[18]，以3%马铃薯汁为碳源、3%黄豆汁为氮源、10%番茄汁作为生长因子，经37 ℃培养10 h后，活菌数比原MRS培养基增加了2.11倍。

（3）《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》（GB 4789.34—2016）中规定的双歧杆菌计数培养基为BBL培养基或MRS培养基，本次实验和相关文献均表明，相同培养条件下，BBL培养基上的活菌数较MRS培养基多，但两者的再现性（r=0.17，r=0.21）均低于再现性限（r=0.45），表明两者的差值明显。因此，在日常样品检验过程中，为了提高工作效率，实验室可选用更为便捷的MRS培养基，若要尽可能多地计算样品中双歧杆菌含量，可选用BBL培养基进行培养计数。

（4）对于能力验证中的实验室间评定，如果多数实验室都采用MRS培养基，只有个别实验室使用BBL培养基，则结果的中位值可能偏低，采用BBL培养基的实验室结果易会落于上四分位值上方，表现为离群值[19]，影响实验室间评定结果的真实性与客观性。因此，对于能力验证中的实验室间评定，能力验证组织方可设置两组不同培养基的实验结果比对，以提高能力验证的客观性和真实性。

本实验通过选取2种培养基（MRS培养基和BBL培养基）对能力验证乳粉样品中双歧杆菌含量进行培养计数，发现BBL培养基的活菌数高于MRS培养基，但两者的再现性低于再现性限，MRS培养基和BBL培养基均可作为双歧杆菌计数培养基。在日常样品检验过程中，实验室可根据实验需求（便捷性需求或更接近真值需求），选取相应的计数培养基。