HPLC法同时测定茶叶中咖啡因和儿茶素

胡旭倩，唐销蓉，姚菲菲，骆 灿

（1.赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江金正检测有限公司，浙江义乌 322000）

茶多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、调血脂和降血糖等药理作用,被广泛应用于食品、医药保健品、功能性饮料和化妆品中[1-3]。儿茶素是茶多酚的主成分，也是其主要的药理活性物质，占茶多酚含量的60%～80%[3-5]。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260超高效液相色谱仪（配紫外检测器）（美国Agilent公司）；超声波振荡器（昆山禾创超声仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；涡旋混合仪（上海精科实业有限公司）；纯水净化仪（杭州永洁达净化科技有限公司）；甲醇为色谱纯（美国大地公司）；甲酸为分析纯（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 流动相的配制

①流动相A（0.1%甲酸水）。1 000 mL水中加入1 mL的甲酸，超声脱气备用。②流动相B（0.1%甲酸甲醇）。 1 000 mL甲醇中加入1 mL的甲酸，超声脱气备用。

1.2.2 标准溶液配制

（1）标准储备溶液的配制。准确称取儿茶素（C）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和咖啡因（CAF）0.100 0 g（精确到0.000 1 g）于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度约为2.0 mg/mL的标准储备液。

（2）标准混合工作溶液的配制。用甲醇溶液稀释儿茶素及咖啡因的混合标准储备溶液，得到适量质量浓度的混合标准工作溶液。

1.2.3 色谱条件

安捷伦C18（4.6 µm×250 mm）色谱柱；柱温30 ℃；流速 0.8 mL/min，进样量20 µL，紫外检测器检测，检测波长：280 nm，流动相条件如表1所示。

表1 流动相条件

1.2.4 提取方法

称取1.0 g均匀磨碎的试样于50 mL离心管中，加入在75 ℃中预热过的70%甲醇溶液30 mL，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，立即移入75 ℃水浴中，浸提30 min，期间不间断搅拌几次，取出，冷却至室温。用70%甲醇溶液定容至50 mL，摇匀，滤液过0.45 µm滤膜，上机待测。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

选取一定浓度的混合标准工作溶液，用二极管阵列检测器在200～400 nm的波长范围内进行扫描，5种儿茶素分别在210 nm和280 nm处有两个最大吸收波长，咖啡因在280 nm处有最大吸收波长。鉴于梯度洗脱时，在210 nm的波长下检测时，基线漂移比较明显，故本方法采用280 nm为检测波长。

2.2 流动相添加剂的选择

本文在相同的色谱条件下，选取一定浓度的混合标准工作溶液进行进样分析，综合考虑6种物质的出峰时间、峰形和分离度等因素，故本文选择甲酸为流动相添加剂。

2.3 提取方法的选择

对同一茶叶样品在相同的色谱条件下，分别用传统加热浸提法和超声浸提法在70%甲醇溶液下提取30 min。结果表明，经过相同时间的提取，传统的加热浸提法提取率明显高于超声浸提法，故本方法选用加热浸提法。

2.4 提取时间的选择

称取同一茶叶样品，在相同的色谱条件下，用70%的甲醇溶液在75 ℃的水浴中分别提取10 min、20 min、 30 min、40 min、50 min和60 min。结果表明，加热浸提时间从30 min开始，提取率开始缓慢下降（详见表图1）。因此，本实验选取30 min为最佳提取时间。

图1 不同提取时间对提取率的影响

2.5 方法线性关系、精密度和重现性

EGC、C、EC、EGCG、ECG和CAF在0.2～2.0 mg/mL的范围内线性良好，相关系数为0.999 11～0.999 95，RSD为0.24%～0.57%，回收率为95.9%～100.6%（详见表2）。本方法简单、准确、重现性好，可用于茶叶中儿茶素类和咖啡因的定量检测。

表2 各组分线性回归方程、线性范围及回收率

3 结论

本研究以茶叶中EGC、C、EC、EGCG、ECG和CAF为研究对象，采用酸性流动相梯度洗脱同时测定了茶叶中5种主要儿茶素和咖啡因的含量。实验结果表明，茶叶中的EGC、C、EC、EGCG、ECG和CAF经70%甲醇溶液在 75 ℃加热浸提30 min，能够充分被提取。本方法简单、准确、重复性好且成本低廉，可用于茶叶中咖啡因和儿茶素的 检测。