lncRNA-CCAT1通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响

李沫宓 淑芳 王孝信（北华大学附属医院妇产科，吉林132011）

宫颈癌是全球最常见的女性恶性肿瘤之一，五年生存率较低［1］，严重威胁着女性健康。因而，寻找宫颈癌治疗和预后的新方法对提高宫颈癌的诊治水平具有重大意义。结肠癌相关转录因子1（colon cancer associated transcript-1，CCAT1）一种长链非编码RNA（lncRNA），在肿瘤的发生和发展中占有重要地位，可参与调控细胞周期、增殖、侵袭与转移等生物学功能。已有研究显示，lncRNA-CCAT1在宫颈癌组织中高表达，与患者肿瘤分期、肿瘤大小及预后相关，并且CCAT1可以促进宫颈癌HeLa和CaSki细胞增殖、侵袭和转移，并抑制其凋亡［2-3］。众所周知，自噬是肿瘤进展中的一个重要过程，然而CCAT1是否对宫颈癌自噬有调控作用目前尚不清楚。多项研究显示，CCAT1能够激活PI3K/Akt信号通路，而PI3K/Akt信号通路可进一步激活mTOR并抑制自噬的形成［4-6］。故推测CCAT1过表达可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制宫颈癌细胞自噬。因此，本研究拟通过向宫颈癌HeLa细胞中转染CCAT1过 表达质粒（pcDNA3.1-CCAT1），探讨CCAT1过表达对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响，并初步阐明其机制。

1 材料与方法

1.1 材料人宫颈癌HeLa细胞株购自上海中科院细胞库；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCAT1过表达质粒pcDNA3.1-CCAT1及其空载对照组质粒pcDNA3.1-vector均由汉恒生物科技（上海）有限公司构建；PI3K特异性抑制剂LY294002购 自 美 国MedChemExpress公 司；Lipo‑fectamineTM2000转染试剂、TRIzol RNA分离试剂均购自美国Thermo Fisher公司；CCK8检测试剂盒、单丹磺酰戊二酸（MDC）染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；Beclin1抗体、p62抗体、LC3抗体、p-PI3K抗体、PI3K抗体、p-Akt抗体、Akt抗体、p-mTOR抗体、mTOR抗体和GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；倒置显微镜购自日本Nikon公司；PCR扩增仪购自美国Thermo公司；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养HeLa细胞，细胞复苏后置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，每2~3 d传代1次。取对数期生长的HeLa细胞，用胰酶消化制备单细胞悬液，以2×105个/孔的细胞接种量将细胞接种于6孔板中，根据实验需求将细胞分为空白对照组（Blank，不做任何处理）、空载对照组（Vector，转染pcDNA3.1-vector质粒）和CCAT1过表达组（pcD‑NA3.1-CCAT1，转染pcDNA3.1-CCAT1质粒）。待细胞融合度达到约85%时，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书，将pcDNA3.1-vector质粒和pcD‑NA3.1-CCAT1质粒分别转染至HeLa细胞中，转染48 h后，采用qRT-PCR检测细胞中CCAT1表达水平以验证转染效果。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中CCAT1表达水平收集各组转染后的HeLa细胞，采用TRIzol法提取各样本的总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度。取3µg总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。引物序列：CCAT1 For‑ward 5'-TTTATGCTTGAGCCTTGA-3'，Reverse 5'-CTTGCCTGAAATACTTGC-3'；GAPDH Forward 5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，Reverse 5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。反应条件为95℃预变性60 s，92℃变性30 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算CCAT1相对表达量。

1.2.3 CCK8检测细胞增殖活性取对数期各组转染后的HeLa细胞，以4×103个/孔的细胞接种量重新接种于96孔板，每组设置4个复孔，分别培养12 h、24 h和48 h后，每孔加入20 µl CCK8溶液，37℃继续孵育4 h，采用酶标仪测定各组在490 nm处的吸光度值（OD），取均值表示各组细胞增殖活性。1.2.4 MDC染色取对数期各组转染后的HeLa细胞，以1×105个/孔的细胞接种量接种于内置有无菌玻片的6孔板中，培养24 h后，弃培养液，1×PBS洗涤3次，加入0.05 mmol/L MDC染色液覆盖皿底，37℃避光染色15 min，1×PBS洗涤3次，取出玻片置于载玻片上，荧光显微镜下拍照观察，其中激发滤光片波长355 nm，阻断滤光片波长512 nm，以细胞内出现点状染色为阳性表现。

1.2.5 Western blot检测细胞中相关蛋白表达水平收集各组转染后HeLa细胞，加入适量RIPA裂解液于冰上裂解，4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。取25 µg蛋白经沸水浴变性后，用10% SDS-PAGE分离蛋白并将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，加入一抗Beclin1（1∶1 000）、p62（1∶1 000）、LC3（1∶2 000）、p-PI3K（1∶500）、PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶2 000）、p-mTOR（1∶500）、mTOR（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育膜过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔或小鼠二抗于室温封闭1 h，ECL发光试剂盒发光显影，化学发光仪采集图像，Image J软件分析条带灰度值，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH蛋白条带灰度值。

1.2.6 PI3K特异性抑制剂LY294002处理细胞取对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板，每孔2×105个细胞，根据实验需求将细胞分空白对照组（Blank，不做任何处理）、CCAT1过表达组（pcD‑NA3.1-CCAT1，转 染pcDNA3.1-CCAT1质 粒）、LY294002组（LY294002，采用10 mmol/L LY294002处理24 h）和联合处理组（pcDNA3.1-CCAT1+LY294002，在CCAT1过表达组的基础上再经10 mmol/L LY294002处理24 h），处理结束后收集各组细胞，采用上述Western blot法检测自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达。

1.3 统计学处理采用SPSS22.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCAT1过表达对HeLa细胞中CCAT1表达水平的影响RT-PCR实验结果（图1）显示，与Blank和Vector组比较，pcDNA3.1-CCAT1组细胞中CCAT1表达水平显著升高（P<0.05），提示pcD‑NA3.1-CCAT1转染成功。

图1 HeLa细胞中CCAT1表达水平比较Fig.1 Expression level of CCAT1 in HeLa cells

2.2 CCAT1过表达对HeLa细胞增殖活性的影响

CCK8实验结果显示，与Blank和Vector组比较，pcD‑NA3.1-CCAT1组细胞在培养24 h和48 h时其增殖活性显著增强（P<0.05），如图2所示。

图2 CCAT1过表达对HeLa细胞增殖活性的影响Fig.2 Effect of CCAT1 overexpression on proliferation activity of HeLa cells

2.3 CCAT1过表达对HeLa细胞自噬的影响

MDC染色结果显示，与Blank和Vector组比较，pcD‑NA3.1-CCAT1组细胞内紫色点状荧光亮度明显减弱，如图3所示。Western blot检测结果显示，与Blank和Vector组比较，pcDNA3.1-CCAT1组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin1蛋白表达水平显著降低（P<0.05），而p62蛋白表达水平显著升高（P<0.05），如图4所示。

图3 MDC染色（×400）Fig.3 MDC staining（×400）

图4 CCAT1过表达对HeLa细胞自噬相关蛋白表达的影响Fig.4 Effects of CCAT1 overexpression on expression of autophagy-related proteins in HeLa cells

2.4 CCAT1过表达对HeLa细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响Western blot实验结果显示，与Blank和Vector组比较，pcDNA3.1-CCAT1组细胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR等水平显著升高（P<0.05，图5），而PI3K、Akt和mTOR蛋白表达水平无显著性变化（P>0.05）。

图5 CCAT1过表达对HeLa细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响Fig.5 Effects of CCAT1 overexpression on expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway proteins in HeLa cells

2.5 联合干预对HeLa细胞自噬相关蛋白表达的影响Western blot实验结果（图6）显示，与Blank组比较，pcDNA3.1-CCAT1组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表达水平显著降低（P<0.05），p62蛋白表达水平显著升高（P<0.05），而LY294002组细胞

图6 LY294002对HeLa细胞自噬相关蛋白表达的影响Fig.6 Effects of LY294002 on expression of autophagy-re⁃lated proteins in HeLa cells

中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表达水平显著升高（P<0.05），p62蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；与pcDNA3.1-CCAT1组比较，pcDNA3.1-CCAT1+LY294002细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表达水平显著升高（P<0.05），p62蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。

2.6 联合干预对HeLa细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响Western blot实验结果（图7）显示，与Blank组 比较，pcDNA3.1-CCAT1组细 胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平显著升高（P<0.05），LY294002组细胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；与pcDNA3.1-CCAT1组比较，pcDNA3.1-CCAT1+LY294002细胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平显著减少（P<0.05）。

图7 LY294002对HeLa细胞p-Akt和p-mTOR蛋白表达的影响Fig.7 Effects of LY294002 on p-Akt and p-mTOR pro⁃tein expression in HeLa cells

3 讨论

越来越多的研究表明，lncRNAs在包括宫颈癌在内的各种肿瘤生物学进程中起关键作用［7］。ZHANG等［8］发现，CCAT1在宫颈癌细胞中高表达并促进癌细胞增殖，抑制凋亡；同时也有研究表明，沉默CCAT1能抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移，最终诱导癌细胞凋亡［9］。自噬是在应激条件下参与细胞稳态的一种分解代谢过程，可影响肿瘤的形成、转移、增殖、能量代谢以及诱导肿瘤细胞存活与死亡等多个方面，通过药物或其他途径使肿瘤细胞过度自噬，并诱导肿瘤细胞发生自噬依赖性死亡，正在成为肿瘤治疗的新策略［10］。众多研究显示，CCAT1可以通过激活PI3K/Akt信号通路抑制细胞自噬［4-6］。但也有研究显示，CCAT1过表达可促进肝癌细胞自噬，这可能是由于肿瘤的异质性所致［11］。本研究结果显示，过表达CCAT1能够通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制宫颈癌HeLa细胞自噬。

自噬的发生与发展需要很多基因和蛋白质参与，多种自噬相关蛋白的表达水平和自噬相关信号的通路活性正在越来越多地被用于宫颈癌的病程和预后分析。Beclin1、LC3和p62都是检测自噬活性的标志性蛋白。当自噬发生时，Beclin1会通过调控其他自噬蛋白定位到前自噬小体膜上来控制自噬小体的形成［12］。细胞自噬过程中，细胞内的LC3-Ⅰ被加工转化为LC3-Ⅱ，并聚集在自噬体膜上，随着自噬过程中自噬体的形成增多，LC3-Ⅰ型蛋白向LC3-Ⅱ型蛋白转换增加，因此可以通过检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ来衡量细胞的自噬活性，而自噬底物蛋白p62参与自噬体的降解过程，其表达量增加可抑制细胞自噬［13-14］。GUO等［11］研究显示，CCAT1诱导肝癌HCC细胞自噬的同时上调细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，并抑制p62的表达；SU等［4］对足突细胞的研究结果显示，CCAT1过表达可以通过抑制细胞自噬减少细胞凋亡，并伴随着细胞内p62蛋白表达水平上调以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低。为了研究CCAT1在宫颈癌细胞中是否具有作用，本实验首先采CCAT1过表达质粒（pcDNA3.1-CCAT1）转染HeLa细胞，发现HeLa细胞增殖能力显著上调，MDC染色实验结果显示，转染组细胞内自噬囊泡聚集较对照组和阴性转染组明显减少。同时，Western blot实验结果显示，CCAT1过表达可以降低HeLa细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ以及下调Beclin1蛋白表达水平，并促进p62蛋白表达，进一步证实过表达CCAT1可以抑制HeLa细胞自噬活性。

自噬受多条信号通路调控，其中PI3K/Akt/mTOR信号通路是研究最为广泛的信号通路之一，其核心蛋白mTOR的活化是决定自噬体形成和成熟的关键蛋白。有研究报道，PI3K/Akt信号通路激活后，会进一步激活下游mTOR的功能，从而发挥细胞自噬的抑制作用［15-18］。为了进一步探讨过表达CCAT1抑制HeLa细胞自噬的可能分子机制，本文研究了过表达CCAT1对p-Akt、Akt、p-PI3K、PI3K、p-mTOR和mTOR表达的影响，并观察PI3K特异性抑制剂LY294002对HeLa细胞自噬的影响。结果显示，CCAT1过表达可以促进HeLa细胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达，而采用LY294002干预会抑制相关通路蛋白的表达，但pcDNA3.1-CCAT1和LY294002联合干预可以逆转LY294002对相关蛋白的抑制作用，表明过表达CCAT1可以通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路的磷酸化抑制HeLa细胞的自噬。

综上所述，本文初步探究了CCAT1对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响，发现CCAT1对宫颈癌Hela细胞的作用机制与PI3K/Akt/mTOR信号通路激活有关，该研究有望为以自噬为靶标的宫颈癌生物治疗研究和药物研发奠定基础。