不同检测方法用于结核病诊断的研究

邱浩庆

结核病是由于结核分枝杆菌(Tuberculosis,TB)感染引发各系统出现的病理改变,具有传染性,损伤人类生命健康,尽管当前已有抗结核药物用于临床治疗,但是由于耐药性的发生,近年来结核病的发病率有所增加,成为严重的公共卫生问题［1,2］。我国结核病患者数目位居世界前列,给社会和家庭带来经济和生活负担,对结核分枝杆菌感染及早发现和诊断,做好防范措施,降低传播风险,是控制结核病的重要环节［3］。当前实验室检测结核分枝杆菌的病原学方法包括病原学学检查、分子生物学检查和免疫学检查,痰培养结核分枝杆菌阳性为细菌病原学检测的金标准,2017 版的肺结核诊断标准新增分子生物学检测阳性为肺结核确诊情况之一［4,5］。本研究选择60 例结核病疑似患者为研究对象,比较实时荧光定量PCR 法、抗酸染色实验法和TB-IGRA法在结核病诊断中的敏感性和特异性等指标,评估其应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2019 年1 月～2020 年1 月在本院就诊的60 例疑似肺结核病患者,根据临床表现、病原学检测、病理学诊断、影像学检查和抗结核药物治疗确诊为肺结核病的患者21 例,年龄15～67 岁,平均年龄(34.88±13.94)岁；确诊为肺部其他疾病的患者39 例,年龄16～72 岁,平均年龄(35.71±12.89)岁,包括慢性阻塞性肺疾病、肺炎、支气管扩张、肺癌等。纳入及排除标准：确诊为肺结核的患者符合《肺结核诊断标准》(WS 288-2017)［6］；确诊为其他肺部疾病的患者未经过抗结核分枝杆菌治疗；排除不配合研究的患者。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 法 取痰样本,用胰酶消化后离心,提取沉淀物中的TB-DNA,使用荧光定量PCR试剂盒(深圳匹基生物工程有限公司)进行TB 的核酸检测,操作和结果判断严格按照试剂盒的说明书进行,使用ABI 7500 PCR 仪进行结果判定。

1.2.2 抗酸染色实验法 结核分枝杆菌有抗酸的特性,可保持石炭酸初染的红色,本实验染色液购自于珠海贝索生物科技有限公司。取痰液样本,严格按照《痰涂片镜检查标准化操作及质量保证手册》［7］进行样本处理、涂片、制片和镜检,结核分枝杆菌在100×油镜下呈细长的红色杆状。

1.2.3 TB-IGRA 法 以无菌抗凝管采集待测者的静脉血5 ml,使用TB-IGRA 酶联免疫分析试剂盒(北京万泰生物药业股份有限公司)检测血液样本中结核分枝杆菌γ-干扰素的水平,操作和结果判断严格按照说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检测方法对于肺结核疑似患者的检测结果TB-IGRA 法、实时荧光定量PCR 法的阳性检出率高于抗酸染色法,差异有统计学意义(χ2=6.400、4.658,P=0.011、0.031<0.05)。TB-IGRA 法、实时荧光定量PCR法的阳性检出率比较差异无统计学意义(χ2=0.150,P=0.699>0.05)。见表1。

表1 不同方法对疑似肺结核患者的检出结果比较(n,%)

2.2 不同检测方法对于结核病诊断的敏感性和特异性比较 病理结果为金标准：60 例疑似患者中,21 例确诊为肺结核,39 例确诊为其他肺部疾病。TB-IGRA 法、实时荧光定量PCR 敏感性分别为76.19%、85.71%,高于抗酸染色法的42.86%,差异有统计学意义(χ2=4.842、8.400,P=0.028、0.004<0.05)；TB-IGRA 法与实时荧光定量PCR 敏感性比较差异无统计学意义(χ2=0.618,P=0.432>0.05)。实时荧光定量PCR 的特异性为97.44%,与抗酸染色法、TB-IGRA法的100.00%、87.18% 比较,差异无统计学意义(χ2=1.013、2.889,P=0.314、0.089>0.05)。TB-IGRA法的检测特异性低于抗酸染色法,差异有统计学意义(χ2=5.342,P=0.021<0.05)。见表2。

表2 不同检测方法对于结核病诊断的敏感性和特异性比较(n,%)

3 讨论

世界卫生组织发布的《2018 年全球结核病控制报告》显示2017 年全球范围内估计新增1000 万结核病患者,约130 万人死于该病,是全球十大死亡原因之一,在单一传染病中其致死率高于艾滋病等其他疾病。中国2017 年新增结核病患者88.9 万例,是结核病高危和高负担国家之一,提高结核病的诊断率,减少耐药性并提升治疗效果,对“终止结核病”的实现至关重要［8］。针对结核分枝杆菌的实施准确便捷的检测可减少漏诊情况,是结核病防控重要且有效的手段,本研究对荧光定量PCR 法、抗酸染色法和IGRAs 法对结核病诊断的价值进行分析。

抗酸染色法是结核分枝杆菌病原学检测的传统方法,此方法存在耗时较长,需2～3 d 才可看到检测结果,对样本中结核分枝杆菌的数量有一定要求,存在较大的漏诊风险,但是其成本低廉、操作简便、对仪器设备无特殊要求且操作易于掌握等优点在结核病诊断中被广泛应用［9］。2017 年世界卫生组织推荐使用美国Cephid 公司的Xpert MTB/RIF 试剂盒对结核分枝杆菌进行检测,该试剂盒能够同时诊断结核病和检测利福平耐药情况,但价格较昂贵,并未广泛应用于基层［10］。实时荧光定量PCR 法以PCR 技术为基础,在核酸扩增过程中加入荧光探针进行标记,通过检测荧光强度评价目的基因的水平,速度快、准确度较高、实用性强,成为发展迅速的分子诊断技术［11］。TB-TGRAs 则通过T 淋巴细胞介导的γ-干扰素免疫反应对患者进行免疫学检测,是当前对结核杆菌感染进行筛查的重要手段。通过不同的检测方法对60 例肺结核疑似患者进行检测,实时荧光定量PCR 法和TB-IGRA 法的阳性检出率显著高于抗酸染色法,提示实时荧光定量PCR 和TBIGRA 法在结核分枝杆菌检测中显示出更好的效果。

敏感性和特异性是评价检测方法重要的指标,实时荧光定量PCR 法和TB-IGRA 法的敏感性显著高于抗酸染色法,和相关文献报道一致［12］；实时荧光定量PCR 的特异性与抗酸染色法、TB-IGRA 法比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。TB-IGRA 法的检测特异性低于抗酸染色法,差异有统计学意义(P＜0.05)。提示实时荧光定量PCR 法在结核病诊断中显示出更好的应用前景。TB-IGRA 检测阳性表明患者体内存在对结合杆菌感染的免疫反应,并不能确定患者体内结核分枝杆菌的存在情况,对于潜伏期或非活动期的结核病检测更有优势。实时荧光定量PCR 检测中出现1 例假阳性病例,可能与操作过程中出现的非特异性扩增或者样本污染等因素有关。

综上所述,实时荧光定量PCR 用于结核病诊断的敏感性和特异性均较高,在结核病的临床诊断中显示出较高的临床应用价值。