miRNA-2861、miRNA-483-3p与多囊卵巢综合征患者内分泌代谢及卵母细胞质量的相关性*

杨潇曼，王克华，王晓丹，马芊芊，石家秀，张明月

(1.山东中医药大学，济南 250011;2.山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心,济南 250011;3.莱阳市人民医院,莱阳 265200)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种以雄激素过高、稀发排卵或无排卵、卵巢多囊样改变为特征的女性内分泌代谢性疾病，患者常由于持续的无排卵状态导致不孕，并可出现胰岛素抵抗、糖脂代谢异常等。PCOS病因复杂，治疗困难[1]。近来研究显示，PCOS患者血清、卵泡液、颗粒细胞等多种体液和组织细胞中均存在miRNA的异常表达[2-4]，这些miRNA与PCOS患者的卵母细胞发育异常和受精失败有关[5]。miRNA在循环系统中数量众多，稳定存在，不受月经周期影响，且取样方便。循环miRNA如能在一定程度上反映卵母细胞及胚胎质量，将有助于早期胚胎种植潜能的评估。本实验拟分析颗粒细胞中miR-2861、miR-483-3p表达水平与卵母细胞及胚胎质量的相关性，并进一步发掘其与血清中miRNA表达的相关性，为血清miRNA在临床上预测早期胚胎发育潜能提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年4月至2018年1月于山东中医药大学附属医院生殖中心行ICSI的PCOS患者58例(PCOS组)和单纯因男方因素不孕的患者23例(对照组)。PCOS组纳入标准：经鹿特丹标准确认的PCOS患者[6]；3个月内未口服类固醇、口服避孕药、二甲双胍或噻嗪类利尿剂等药物；未合并高血压、高血脂症、糖尿病、先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征或分泌雄激素的肿瘤。本实验经医院伦理委员会批准，受试者同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基本信息及病史采集 采集患者的个人信息，如姓名、年龄、身高、体重等,以及患者病史，如不孕年限。

1.2.2 临床指标采集 患者月经期2～4天于本院门诊检验室抽取空腹静脉血，测定基础内分泌及血液生化。收集患者睾酮、空腹胰岛素、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等临床数据，同时于取卵日留取血清样本于-80℃保存备用。

1.2.3 实验室指标采集及评估 阴道超声引导下穿刺取卵，4～6h后去除卵外周颗粒细胞，高倍倒置显微镜下行卵母细胞质内单精子显微注射受精，受精后16～18h观察胚胎情况，对胚胎进行评估并选择优质胚胎移植。记录HCG日>14mm卵子数、获卵数、MII卵数、2PN数、2PN卵裂数及优质胚胎数等，计算获卵率、MII卵率、正常受精率、2PN卵裂率及优质胚胎率(获卵率=获卵数/HCG日>14mm卵子数；MII卵率=MII卵数/获卵数；正常受精率=2PN卵数/获卵数；2PN卵裂率=2PN卵裂数/2PN数；优质胚胎率=优质胚胎数/2PN卵裂数)。取卵结束后于卵泡液中提取颗粒细胞，-80℃保存备用。

1.2.4 miRNA检测方法 将收集的血清和颗粒细胞标本分别按miRNAeasy试剂盒(QIAGEN，德国)说明书步骤提取总RNA，使用miRNA逆转录试剂盒(TAKARA，日本)将总RNA反转录为cDNA，将cDNA样品配置Real-time PCR反应体系，进行Real-time PCR反应。内参及目的miRNA引物序列由大连宝生物工程提供。miR-2861引物序列：5'-AAATGGCGGTGGGCGGAAA-3'；miR-483-3p引物序列：5'-TCACTCCTCTCCTCCCGTCTT-3'；U6-F引物序列：5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'；U6-R引物序列：5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3'。

2 结 果

2.1 PCOS组与对照组的临床指标 PCOS组的BMI、睾酮、空腹胰岛素、甘油三酯、低密度脂蛋白显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，PCOS组的获卵率、MII卵率、正常受精率、优质胚胎率降低，获卵数升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 PCOS组与对照组的临床指标比较

表2 PCOS组与对照组的实验室指标比较

2.2 PCOS组与对照组血清和颗粒细胞中miR-2861、miR-483-3p表达水平比较 PCOS组血清和颗粒细胞中miR-2861表达水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；PCOS组血清和颗粒细胞中miR-483-3p表达水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。miR-2861在PCOS组血清和颗粒细胞中的表达水平呈正相关，差异有统计学意义(P=0.418，P<0.05)；miR-483-3p在PCOS组血清和颗粒细胞中的表达水平呈正相关，差异有统计学意义(P=0.447，P<0.05)。

图1 血清与颗粒细胞中miR-2861、miR-483-3p相对表达量(prism8软件)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 PCOS组血清中miR-2861、miR-483-3p表达水平与临床指标的相关性 PCOS组血清中miR-2861表达水平与空腹胰岛素、总胆固醇水平呈负相关(P<0.05)，miR-483-3p表达水平与睾酮、空腹胰岛素、低密度脂蛋白水平呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 PCOS组血清中miR-2861、miR-483-3p表达水平与临床指标的相关性

2.4 PCOS组血清与颗粒细胞miR-2861、miR-483-3p表达水平与实验室指标的相关性 PCOS组血清和颗粒细胞中miR-2861表达水平与MII卵率、2PN卵裂率、优质胚胎率均呈正相关，血清miR-2861表达与正常受精率呈正相关(P<0.05)，颗粒细胞miR-2861与获卵率呈正相关(P<0.05)。

PCOS组血清和颗粒细胞中miR-483-3p表达水平均与获卵率、MII卵率、2PN卵裂率、优质胚胎率呈正相关，且颗粒细胞中miR-483-3p表达与正常受精率呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 PCOS组血清与颗粒细胞中miR-2861、miR-483-3p表达水平与实验室指标的相关性

3 讨 论

MicroRNA是一种具有组织特异性和发育阶段特异性的内源性调控非编码RNA[7]，主要通过转录抑制或对mRNA的切割或降解实现对人体生理病理状态的调节。目前大部分PCOS相关miRNA的研究集中在单一部位的miRNA差异表达及其意义[8],包括血清miRNA与雄激素释放、胰岛素抵抗、脂代谢异常之间的相关性，以及颗粒细胞miRNA与卵泡发育、卵母细胞质量之间的相关性[9-11]。本研究将二者结合，并联合辅助生殖技术，探讨血清miRNA对PCOS患者胚胎质量及生殖预后相关性的研究[12]。

有证据表明，PCOS合并代谢综合征的患者，其糖脂代谢紊乱同样表现在卵泡液中。较高浓度的胆固醇和胰岛素可使卵泡液中炎性因子平衡失调，从而形成慢性炎性反应的微环境，是造成PCOS患者卵母细胞质量下降的重要机制之一[13]。此外，高雄激素血症可降低子宫内膜的容受性，干扰卵母细胞的发育能力，继而影响PCOS患者优质胚胎的形成。本研究结果显示，与对照组相比，PCOS患者血清miR-2861表达下调，且血清miR-2861表达水平与空腹胰岛素、总胆固醇水平呈负相关(P<0.05)。提示miR-2861不仅参与PCOS发病，还是PCOS患者出现糖脂代谢紊乱的重要病理机制。有文献提示，miR-2861可靶向TSP-1和HDAC5[14-15]，两者均与糖脂代谢密切相关[16-17]。miR-2861可能通过多个信号通路参与PCOS糖脂代谢紊乱过程，进而抑制卵母细胞发育。

本研究结果显示，PCOS患者血清和颗粒细胞中miR-483-3p表达下调。这与miR-483-3p在PCOS患者卵丘细胞中低表达的研究结果一致[18]。本研究发现，血清中miR-483-3p表达水平与睾酮、空腹胰岛素、低密度脂蛋白水平呈负相关(P<0.05)。miR-483-3p可直接靶向胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)[19]。IGF1能促进糖原和脂肪的合成，具有调节糖脂平衡的作用[20]。当IGF1表达升高时，体内血糖、血脂均可能发生代谢异常。IGF1还可协同LH作用于卵泡膜细胞受体增加雄激素的表达。本研究结果显示，miR-483-3p可能通过IGF1信号通路参与PCOS高雄激素血症及糖脂代谢紊乱的病理过程，从而抑制卵泡发育。

胚胎源自精卵的结合，来自卵母细胞的母源性基因对早期胚胎发育具有重要作用[21]。研究显示，这些母体物质大部分是以mRNA和蛋白质的形式存在，miRNA则可通过靶向降解mRNA间接调控早期胚胎的发育[22]。动物实验显示，miRNA不仅广泛参与卵泡发育和卵母细胞成熟的过程，而且miRNA在卵泡的募集、选择以及闭锁过程中具有表达阶段特异性[23-24]。本实验发现，PCOS患者颗粒细胞中miR-2861低表达与获卵率、MII卵率、2PN卵裂率、优质胚胎率呈显著正相关，表明miR-2861低表达可在一定程度上对PCOS患者卵母细胞质量和胚胎质量产生不利影响，证实了miR-2861对胚胎质量的正性调节作用。本研究结果显示，PCOS组血清和颗粒细胞中miR-483-3p表达水平与获卵率、MII卵率、2PN卵裂率、优质胚胎率显著正相关，这与Fischer等[25]动物实验结论相一致。miR-483-3p可能通过靶向IGF1抑制人卵巢颗粒细胞增殖，调控与细胞周期阻滞相关的重要调控因子，诱导细胞周期阻滞[19]，进而对卵母细胞发育产生不利影响。生殖细胞局部miRNA能调控配子质量及胚胎质量，PCOS患者颗粒细胞中异常表达miR-2861、miR-483-3p可能使卵母细胞质量下降，可能对胚胎的继续发育产生负面影响。

颗粒细胞中miR-2861、miR-483-3p表达与卵母细胞质量密切相关，但标本较难获得，外周血miRNA具有数量众多、存在稳定、具备抗核酸酶活性及易检测等生理特性，可成为无创性生物诊断标记物。本研究对血清与颗粒细胞中miR-2861、miR-483-3p表达水平进行相关性分析，发现miR-2861、miR-483-3p在上述两部位中的表达水平具有显著相关性，且均与卵母细胞质量及胚胎质量密切相关。提示血清中miR-2861、miR-483-3p可在一定程度上反映卵巢基础状态，提示通过检测血清中miR-2861及miR-483-3p表达水平可间接预测PCOS患者卵母细胞质量及胚胎发育潜能。

目前，miRNA对生殖细胞及胚胎发育潜能作用的具体调控机制和调控网络认识仍不清楚，有待对miR-2861、miR-483-3p介导糖脂代谢紊乱以及高雄激素血症的相关信号传导通路做深入系统的研究，以有助于我们更全面且深入地了解PCOS卵巢功能障碍的机制，进而有效、精准地预测患者的生殖预后。