孕妇VDR基因FokI位点多态性与胎儿孤立性股骨短小的相关性*

陈杨萍，李苑艳，朱非白，胡晓霞，周丽丽

(温州市中心医院 a.妇产科 325000;b.中心实验室,温州 325000)

胎儿肢体畸形是最常见的先天性骨骼系统畸形之一，据有关研究其发病率为1/500[1]。胎儿股骨长度(femur length,FL)是孕期超声检查评价胎儿宫内生长及骨骼发育的常用指标，胎儿孤立性股骨短小(isolated short femur,ISF)指在超声检查中发现胎儿双侧对侧性股骨短小，无其余结构畸形，且无异常细胞、分子遗传学发现。国内外关于引起ISF的病因研究较少，且无有效的宫内治疗措施。亦有研究表明[2-3]，孕妇钙的摄入量与胎儿FL相关，而孕妇钙的摄入量受体内维生素D及维生素D受体(Vitamin D receptor，VDR)基因的调控。目前研究发现，VDR基因FokI位点多态性对骨代谢有重要的影响。本课题组研究孕妇VDR基因FokI多态性与ISF的相关性，探讨胎儿ISF的发生遗传易感因素。

1 资料与方法

1.1 研究对象 随机选取2018年6月至2020年1月在温州市中心医院产检的B超提示胎儿股骨短小的120例孕妇作为观察组。纳入标准：胎儿股骨短小参照低于同孕周平均值2个标准差[4]。排除标准：(1)合并其他超声结构异常及胎儿染色体异常的非孤立性股骨短小；(2)妊娠期糖尿病、高血压病、风湿免疫性疾病、染色体异常、甲状腺异常及骨代谢异常相关疾病。随机选取120例胎儿超声结构正常的正常产检孕妇作为对照组，本研究经医院伦理委员会批准，孕妇知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法 于孕早期测量孕妇身高、体重及其配偶身高，孕23周行胎儿系统超声检测时测胎儿股骨长度，设计问卷调查表，记录孕妇产次、孕期户外活动时间、服用钙量及维生素D等情况。

1.3 PCR-Pyrosequencing遗传分析技术(PCR-焦磷酸测序)测定血清VDR基因FokI位点 用长沙三济生物科技有限公司全血DNA基因提取试剂盒提取患者DNA，置-20℃保存。反应体系25μL，扩增条件：95℃预变性3min；95℃ 15s,60℃ 1min，共45个循环。前引物：GTGGCCTGCTTGCTGTTC，后引物：ACAGATCCGGGGCACGTT，测序引物：TTGCTGTTCTTACAGGG。用PyroMark Q24测序仪随机选择10%样本PCR产物进行焦磷酸基因测序，用PyroMarkQ24MDxSoftware查看测序结果。酶联免疫法检测分娩前孕妇血清及新生儿脐静脉血25-羟维生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D]水平。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 为评价基因频率估计的可靠性，对120例对照组孕妇VDR基因FokI位点的基因型进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果显示其等位基因的位点分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，表明该组资料在人群中具有良好的代表(χ2=1.67，P>0.05)。

2.2 孕妇的基本情况 观察组和对照组的孕妇身高、年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、产次、日照时间、服用钙量和配偶身高比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 孕妇的基本情况

2.3 观察组和对照组基因型对比 观察组TT型37例，占30.83%，孕妇及新生儿脐血25-羟维生素D分别为(35.14±11.89)mmol/L和(35.42±11.78)mmol/L;TC型63例，占52.5%,孕妇及新生儿脐血25-羟维生素D分别为(43.28±14.00)mmol/L和(45.71±13.67)mmol/L;CC型20例，占20.83%，孕妇及新生儿脐血25-羟维生素D分别为(55.14±13.71)mmol/L和(55.85±16.07)mmol/L。对照组孕妇中TT型28例，占23.33%，孕妇及新生儿脐血25-羟维生素D分别为(36.00±9.67)mmol/L和(38.71±9.57)mmol/L;TC型57例，占47.5%，对应的25-羟维生素D分别为(44.57±10.73)mmol/L和(47.71±13.27)mmol/L;CC型35例，占29.16%,对应的25-羟维生素D分别为(54.00±8.58)mmol/L和(57.57±10.17)mmol/L;不同基因型中以TT型的孕妇及新生儿脐血25-羟维生素D的含量最低，CC型最高，差异有统计学意义(P<0.05)(表2、3)。观察组TT+TC基因型的比例(83.33%)大于对照组(70.83%)，差异有统计学意义(χ2=5.307,P=0.015)(表4)。

表2 观察组不同基因型孕妇血清及脐血25(OH)D比较

表3 对照组不同基因型孕妇血清及脐血25(OH)D比较

表4 两组孕妇VDR基因FokI位点不同基因型的比率比较[n(%)]

3 讨 论

胎儿肢体骨骼发育畸形是一种常见的先天性畸形，股骨长度是筛查胎儿骨骼系统异常及评估是否胎儿宫内生长受限的重要指标。胎儿股骨短小国际上一般采用低于同孕周胎儿股骨长的第5百分位数，而国内一般采用低于同孕周平均值2个标准差或FL/足长比值<0.88。根据股骨短小是否合并其他超声结构异常或细胞遗传学异常分为孤立性股骨短小和非孤立性股骨短小。目前国内外研究较多的是非孤立性股骨短小，其常见原因是遗传性骨骼系统疾病。目前研究明确的四种遗传性骨病主要有：(1)致死性骨发育不良(thanatophoric dysplasia，TD):常染色体显性遗传，是有FGFR3基因的第7外显子发生点突变所致；(2)成骨发育不全(osteogenesis imperfecta，OI)：一种常染色体显性遗传病，是一种由编码I型胶原蛋白α链的COL1A1/COL1A2基因突变导致胶原代谢紊乱的全身结缔组织疾病；(3)软骨发育不全(achondroplasia，ACH)：亦是常染色体显性遗传，是由FGFR3基因第10外显子发生点突变引起;(4)单纯性短肢畸形：十分罕见，可能与染色体异常相关，但具体机制不详。前3种骨骼畸形共同的主要表现为严重的短肢畸形伴发其它超声结构异常，且可通过介入性产前诊断得到病因学诊断。另有一些研究表明与胎儿非整倍体染色体异常有关，尤其是21-三体综合征，但阳性预测值不高[6]。对于以上明确基因突变的骨骼发育异常的非孤立性股骨短小胎儿均选择终止妊娠。因孤立性股骨短小较难从病因上诊断，故目前国内外对其研究较少。Goetzinger等[7]的大样本回顾性分析对照研究表明,ISF组的胎儿宫内生长受限发生率高于对照组。Ozlü等[8]研究表明，ISF组早产儿发生率、新生儿重症监护病房住院率、低出生体质量儿发生率及孕妇吸烟率均高于对照组，孕妇体质量指数、分娩期体质量指数及平均身高低于对照组。表明ISF发生可能与孕母的身高、体重及吸烟相关。有报道[9]指出，ISF与母体因素或父母身高矮小导致骨相关生长因子异常或胎儿血流再分布有关。亦有研究表明，孕妇钙的摄入量与胎儿股骨的长度相关[10]，而孕妇钙的摄入量受体内维生素D及VDR基因的调控。目前研究发现，VDR基因多态性主要有4个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点对骨代谢有重要的影响，分别为FokI、Bsm I、Apa I及Taq I限制性酶切位点。FokI限制性位点多态性位于2号外显子，存在T/C转换多态性，导致编码氨基酸密码子427ACG>ATG突变，是目前所了解的VDR基因多态性中唯一改变氨基酸序列长度的位点[11]，以等位基因F、f表示，f表示存在FokI酶切位点，F表示缺乏FokI酶切位点，可有3种不同的组合(FF、Ff、ff或CC、TC、TT)。VDR在造骨细胞及软骨细胞中均有表达[12]，其可特异地结合1，25(OH)2D3，并作用于靶细胞核，发挥调节成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞分化、增生的生物学作用，从而影响骨钙化、骨骺生长。目前研究表明，VDR基因FokI位点多态性与骨质疏松[13]、钙吸收及佝偻病[14]等骨代谢性疾病相关。Minamitani等[15]报道VDR基因FokI多态性与人的身高相关。蒋旭等[16]指出人的身高与VDR基因的多态性相关。吴越等[17]的动物实验中提示VDR基因多态性与子代的骨骼发育相关。Endo I等[18]研究中，敲除VDR基因的小鼠中可出现肌纤维的萎缩，表明VDR基因可促进肌纤维的发育。维生素D是人体必须的营养物质，在体内经25羟化酶羟化后生成25(OH)D3，再进一步转化成1,25(OH)2D3，最终与细胞内特异的维生素D受体结合，调控免疫和细胞生长，发挥调节钙磷代谢和胰岛素等内分泌作用。25-羟维生素D3是循环中维生素D的主要存在形式，因其半衰期较长，可达1～2个月，而且几乎不受任何因素调节，故一般以血清25(OH)D3水平作为反映体内维生素D的营养状况[19]。目前多数专家对维生素D不足及缺乏的标准是：不足为25(OH)D3水平处于50～74nmol/L，缺乏为25(OH)D3水平低于50nmol/L[20]。维生素D与人体的骨骼代谢有着密切的关系，维生素D通过与VDR相结合而发挥生物效应。本研究中我国孕妇的维生素D水平大多不足或者缺乏，TT型基因型的孕妇及脐血25(OH)D3含量最低，TC型基因型次之，CC型的基因型最高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明VDR基因位点TT型吸收维生素D能力差，与本课题组前期研究结果一致[21]。本研究中，观察组的TT+TC基因型的比例高于CC基因型，差异有统计学意义(P<0.05),表明携带突变基因F(C)有利于胎儿股骨的发育，其机理可能是因为等位基因f突变成F,使基因转录活性增强，增强了VDR蛋白对维生素D的亲和力及活性，同时增加了肠道吸收维生素D的能力，有助于胎儿骨骼和肌纤维的发育。本研究中，TT型孕母血清中维生素D的水平较低。胎儿体内的VitD来自母体，当母体VitD缺乏时直接导致胎儿体内VitD水平的下降；另一方面，VDR在本质上是一种配体依赖性核转录因子，需由配体激活，当作为配体的VitD水平下降时，会引起其受体蛋白降解加快，从而导致VDR表达减少[22]。VDR表达减少影响了对靶基因，如与骨骼发育有关基因DMP1、BMP2、Cbfα1等的转录和翻译，导致骨骼发育不良。本实验表明，孕妇VDR基因FokI位点T基因可能是孤立性股骨短小发生的易感因素。但本研究样本量不大，尚需多中心大样本研究予以进一步验证。