口腔扁平苔藓病损区Tim-3、Gal-9、IFN-γ的表达及临床意义

王 珣 王冬平 蔡 扬

1.贵州医科大学附属口腔医院牙周黏膜科，贵州贵阳 550004；2.辽宁省大连市友谊医院口腔科，辽宁大连 116011

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜皮肤常见的慢性炎症性疾病，国内学者发现在OLP患者组织中存在CD4+T 淋巴细胞中的辅助性T 细胞（helper T cell，Th）1/Th2的平衡失调[1]。Monney 等[2]发现T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3，Tim-3）家族，是一个新基因家族，表达于T 细胞。人类Tim-3 可以作为Th1的特异性表面标志[3]。目前研究认为，由于Tim-3 与半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）的结合使得Tim-3/Gal-9 通路激活对Th1 细胞效应有抑制作用[4]。本研究探讨Tim-3、Gal-9、γ 干扰素（interferon-γ，INF-γ）在OLP 患者组织中的表达，探讨Tim-3/Gal-9 信号通路在OLP 局部病损形成中的作用

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

兔抗人Tim-3 多克隆抗体（货号：sc-292389）、兔抗人Gal-9 多克隆抗体（货号：0604R）、兔抗人IFN-γ多克隆抗体（货号：BA0952）、0.02 mol/L PBS 缓冲液、0.1 mol/L 枸橼酸盐缓冲液（pH=6.0）（货号：GL1721-XL）、SABC 试剂盒（货号：QN1224）、DAB 显色试剂盒（货号：AR1022）均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 研究对象

选择2016 年10 月至2019 年10 月贵州医科大学附属口腔医院（以下简称“我院”）牙周黏膜科诊治的经病理确诊的41例OLP 患者为OLP 组，其中非糜烂型21例，糜烂型20例。排除经期或孕期妇女，口腔检查有炎症及患有其他口腔黏膜病或肿瘤等，伴皮肤损伤，伴全身系统性疾病，局部和或全身使用过调节免疫、抗生素等相关制剂。

OLP 组男17例，女24例；年龄30～71 岁，平均（46.3±17.5）岁。另外选取同期于我院诊治的10 名正常口腔黏膜人群作为正常组，其中男6 名，女4 名；年龄25～76 岁，平均（47.1±18.2）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.3 研究方法

所有标本分成两份，一份在液氮中速冻，保存于-80℃冰箱；另一份固定于10%甲醛溶液中，石蜡包埋，苏木精-伊红染色及病理诊断，病理记分（淋巴细胞浸润程度轻度、中度、重度分别记1、2、3 分，基底细胞液化程度轻度、中度、重度分别记1、2、3 分）参考张筱林等[5]提出的OLP 病理记分标准。

1.3.1 免疫组织化学染色 按SABC 试剂盒法步骤进行，一抗浓度分别为Tim-3（1:100）、Gal-9（1∶200）、IFN-γ（1∶100）。每批染色阴性对照用PBS 代替，Tim-3、Gal-9、IFN-γ 分别以人淋巴结、肾组织、胰腺癌标本作为阳性对照。

1.3.2 结果判定方法 Tim-3、Gal-9 阳性表达均为细胞浆和/或细胞核上呈淡黄色或棕黄色颗粒。IFN-γ阳性表达为细胞浆和/或细胞膜上呈黄色或黄褐色颗粒。采用盲法观察每张切片的5 个高倍视野（400×），总共计数至少500 个细胞，计数阳性细胞的百分比。Tim-3、Gal-9 参照李咏等[6]的方法，IFN-γ 参照潘玉霞等[7]的方法，每张切片最终分数按阳性率和染色强度两个参数的乘积计算，0～4 分为阴性，5～12 分为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关分析采用Spearman 秩相关分析。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tim-3、Gal-9、IFN-γ 在OLP 病损区的表达

正常组口腔黏膜未见Tim-3 阳性细胞。OLP 组织中上皮层的阳性细胞为基底细胞、棘层细胞，见图1A；固有层的阳性细胞为浸润的淋巴细胞，见图1B。OLP 组上皮层、固有层Tim-3 阳性表达率分别为80.48%（33/41）和85.37%（35/41），高于正常组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

OLP 组织中Gal-9 阳性细胞主要为上皮层的棘细胞和基底细胞，见图1C。OLP 组Gal-9 阳性细胞表达率为78.05%（32/41）低于正常组的100.00%（10/10），差异有统计学意义（P ＜0.05）。

OLP 组IFN-γ 阳性细胞主要为固有层内浸润的淋巴细胞，见图1D。OLP 组IFN-γ 阳性表达率为73.17%（30/41），高于正常组（正常组织仅为阴性表达），差异有统计学意义（P ＜0.05）。

图1 Tim-3、Gal-9、IFN-γ 在OLP 病损区的表达（免疫组织化学SABC 法，400×）

OLP 组织中，Tim-3 表达在上皮层、固有层呈正相关（r=0.756，P=0.015）；Tim-3 与Gal-9 表达在上皮层呈负相关（r=-0.426，P ＜0.05）；Tim-3 和IFN-γ表达在固有层呈正相关（r=0.423，P ＜0.05）。

2.2 OLP 患者病理特征与Tim-3、Gal-9、IFN-γ的相关性分析

淋巴细胞浸润记分与Tim-3 在上皮层与固有层的阳性表达呈正相关（r=0.504、3690.613，P ＜0.05），与Gal-9 呈负相关（r=-0.303，P ＜0.05）；基底细胞液化浸润记分与Tim-3 在上皮层阳性表达、IFN-γ 阳性表达呈正相关（r=0.333、0.369，P ＜0.05）。见表1。

表1 OLP 患者病理特征与Tim-3、Gal-9、IFN-γ的相关性分析（例）

3 讨论

本课题组前期研究结果显示：OLP 组织病损区主要表现为Th1 细胞优势，导致Th1 和Th2 细胞之间的失衡。研究发现Tim-3 在活化的CD8+T 细胞、CD4+T 细胞上表达，少量也会出现在Th17 细胞中[2]。Tim-3 对炎症细胞有激活作用，从而对炎症反应有促进作用[8]。Tim-3 能够使Th1 细胞发生迁移，并对细胞效应功能发挥作用，主要表达在Th1 细胞表面[9]。研究发现[10]，OLP 中Th1 细胞分布的淋巴细胞浸润带紧贴上皮基底膜。Th1 免疫应答的调控可能是由于Tim-3的作用，Tim-3 成为一个负调节蛋白大量活化参与。OLP病损区固有层Th1 大量增多，促进IFN-γ 分泌，可使淋巴细胞向上皮层入侵，大量的Tim-3+Th1 淋巴细胞出现在上皮层。有学者发现，支气管上皮细胞有Tim-3 表达，能够促进免疫反应[11]。Tim-3 表达在已分化的Ⅰ型CD8+Te 细胞（Tcl 细胞）表面[12]。在病毒感染中，发现Tim-3 能引导CD8+T 失活[13]。推测活化的Tim-3 促使CD8+T 失活，免疫耐受作用降低[14]。

OLP 病损区IFN-γ 表达增高。已有研究显示，在体内IFN-γ的分泌促进淋巴细胞浸润数目增多，从而诱发苔藓样反应和迟发型超敏反应[15-16]。Th1 细胞在OLP 病损中活化，Tim-3 被激活主要用于调控IFN-γ的分泌，发挥抑制免疫耐受的作用。

Gal-9 即Tim-3 配体，主要在巨噬细胞、抗原提呈细胞、CD4+T 细胞和树突状细胞中表达。主要在炎症反应的调控和介导细胞分化、细胞间聚集、黏附、凋亡上发挥作用[17]。以往研究发现[18]，体内Th1 介导细胞活性功能的减少是由于Gal-9 对Th1 细胞可选择性清除。Th1 功能效应可能由Tim-3/Gal-9 通路调控。体外实验发现细胞聚集和死亡的原因是由于表达在Th1 细胞的Tim-3 与Gal-9 结合，两者结合在短时间可促进Ca2+内流[19]。Gal-9 末端有糖类识别域N、C，他们与Tim-3 结合时结合模式及黏附性都不一样，N 末端糖类识别域作用为调节固有免疫，而C 末端糖类识别域作用为诱导T 细胞凋亡，发挥免疫作用，可以清除Th1 细胞[20-21]。Zhu 等[22]在实验性自身免疫性脑脊髓炎中发现，Gal-9 可清除CD4+T 细胞从而减少IFN-γ 分泌，在体内通过免疫反应用于减轻炎症，从而减轻病程进展。在小鼠肾毒血清肾炎模型中，CD8+T 细胞被Gal-9 选择性清除，可发挥介导细胞凋亡，抑制免疫[23]。推测OLP 局部病损中Gal-9 表达减少，其清除CD8+T 细胞能力减弱，在OLP 局部病损中CD8+T 细胞不断增加发挥其介导细胞毒性T 细胞作用。Gal-9 表达减少，致使Th1 细胞表面的Tim-3 与Gal-9 结合受阻，Tim-3/Gal-9 信号通路[24]阻断无法清除Tim-3+Th1 细胞，Th1 效应细胞持续性高应答[25]，促进IFN-γ 分泌。IFN-γ 可以活化角质形成细胞上Fas 抗原表达，进而诱导角质形成细胞凋亡。故推测在OLP 中基底细胞液化可能是由于IFN-γ 通过上调角质形成细胞凋亡引起[26]。

本研究提示OLP 患者局部病损中Tim-3/Gal-9通路异常，使Th1 效应细胞增强，可能参与了OLP 病损区病理损伤过程。