肺腺癌患者预后及EGFR基因T790M突变状况的相关因素分析

耿一萌，孟 轲，王一迪；杨珍珍，梅叶玲，张腾飞，马 望

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，给人类生命健康带来严重危害[1]。大约85%的肺癌为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]，其中肺腺癌为NSCLC 中主要的亚型之一。在亚洲，近50% 晚期NSCLC 患者中存在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变[3]，EGFR-酪 氨酸激酶抑制（EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）靶向治疗对该类患者具有显著的疗效，但耐药性限制了靶向治疗疗效[4]。最常见的耐药机制是在EGFR基因20 外显子位点790中甲硫氨酸取代了苏氨酸，即发生了T790M 突变[5]，然而目前临床上仍有部分耐药患者无法行二次基因检测或因检测结果假阴性，导致无法明确T790M 基因突变状况。因此，探索影响患者接受EGFR-TKIs 治疗疗效的预后因素及耐药性T790M 突变等生物标志物，对指导临床诊疗具有重要意义。

临床上容易获得的临床病理特征是目前有潜力的疾病预测因子。较多研究发现临床合并指数与肿瘤风险和预后相关，如在一定程度上反映体内炎性水平的中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）、血 小板与淋巴细胞比值（platelet lymphocyte ratio，PLR）以及单核细胞与淋巴细胞比值（monocyte lymphocyte ratio，MLR）等[6-7]，但在接受EGFR-TKIs 靶向治疗的NSCLC 患者中尚未有相关研究报道。同上有研究显示，肝酶不仅能反映患者的肝功能，也在一定程度上参与患者代谢及免疫状况，较多回顾性研究发现肝酶可以预测各种癌症预后[8-9]，但在肺癌患者中的报道较少。目前已证实，临床上携带敏感EGFR突变的NSCLC 大多具有以下特征：女性、从不吸烟、东亚人和病理类型为肺腺癌[10]，但在第一代EGFR-TKIs 耐药的肺癌患者中，尚未有研究报道与T790M 耐药突变相关的临床特征。因此希望开展本研究，以探讨简单的临床病理因素是否可作为肺腺癌患者EGFR-TKIs 靶向治疗预后及EGFR-TKIs 耐药后T790M 突变状况的预测因子。

1 资料与方法

1.1 患者资料

收集2015 年1 月—2018 年12 月就诊于本院的137例肺腺癌患者的资料。纳入标准：（1）病理和组织学证实为肺腺癌，发生远处转移，临床TNM 分期为Ⅳ期；（2）根据下一代测序（next generation sequencing，NGS）结果提示，所有患者均为EGFR基因的19 外显子缺失突变（19Del）或21 外显子L858R 点突变（21L858R），无其他复杂突变及T790M 突变；（3）初治应用第一代EGFR-TKIs 药物[吉非替尼片（gefitinib）或者盐酸埃克替尼片（icotinib）]治疗；（4）至少有一个可评估的病变；（5）有足够的骨髓、肾脏和肝脏功能；（6）临床资料和随访资料完整。排除标准：脑转移患者、肝转移患者、预计生存期＜3个月或临床资料和随访资料不完整的患者。

1.2 收集的临床病理特征

收集患者年龄、性别、吸烟史、器官转移的数量、EGFR突变类型、EGFR-TKIs 药物、Ki-67 增殖指数，淋巴细胞计数、血小板计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、血清白蛋白以及γ-谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyl transferase，γ-GGT）等临床指标；以及由实验室检验指标计算出的临床参数：PLR ＝外周血血小板计数（×109/L）/ 外周血淋巴细胞计数（×109/L），NLR ＝外周血中性粒细胞计数（×109/L）/ 外周血淋巴细胞计数（×109/L），MLR ＝外周血单核细胞计数（×109/L）/ 外周血淋巴细胞计数（×109/L），营养预后指数（prognostic nutritional index，PNI）＝血清白蛋白值（g/L）＋5×外周血淋巴细胞计数（×109/L）。

1.3 外周血及病理组织检测方法

在治疗前1 周内，清晨采集所有研究对象的空腹静脉血，用真空采集管分别收集静脉血2及4 mL。采用血细胞分析仪检测淋巴细胞计数，血小板计数，中性粒细胞计数，单核细胞计数；双缩脲法检测血清白蛋白；采用IFCC 速率法检测γ-GGT。患者行组织活检术取得肿瘤组织标本，应用免疫组织化学法检测Ki-67 的表达水平。

1.4 治疗方法

所有患者均接受第一代EGFR-TKIs 药物治疗，根据患者意愿选择吉非替尼或者盐酸埃克替尼[ 吉非替尼片（批准文号：国药准字J20 100014；生产厂家为AstraZeneca UK Limited）；口服250 mg/次，1 次/d；盐酸埃克替尼（批准文号：国药准字H20 110061；生产厂家为贝达药业股份有限公司）；口服125 mg/次，3 次/d]。患者在治疗期间可以根据病情给予止痛和营养等对症支持治疗，但不予其他抗肿瘤治疗，用药持续到无法耐受药物不良反应或病情进展为止。4 周为1 个疗程，前2 个疗程每次结束后均行影像学复查，之后每2 个疗程行影像学复查1 次。

1.5 疗效评估与随访

基于实体瘤疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST）（版本1.1），应用计算机断层扫描（computed tomography，CT）评估病情。主要终点是无进展生存期（progression free survival，PFS），即患者从接受治疗开始，至疾病进展或者发生因为任何原因的死亡之间的时间。通过调取患者CT 影像或打电话以获取患者疾病进展情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6 统计学软件对研究数据进行统计学分析。应用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线并计算生存率，采用logrank 法进行组间生存率差异的比较；使用COX比例风险回归模型进行多因素生存分析。Fisher确切概率法用于分类变量的相关性分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者特征

137例患者中男性51例（37.2%），女性86例（62.8%）；中位年龄为59 岁（范围：30～83岁）；EGFR基因19Del 突变者73例（53.3%），21L858R 突变者64例（46.7%）；Ki-67 增殖指数中位数为30%（范围：5%～90%）。γ-GGT 中位值为22.00 U/L（范围：4.93～155.00 U/L），正常值为0～58 U/L，本研究中以58 U/L 为临界值，按γ-GGT 值将患者分为2组[即正常组121例（88.3%），异常组16例（11.7%）]。根据患者治疗前血液学检验结果计算获得指标：中位PLR 值为146.5（范围：51.9～723.0），中位NLR 值为2.62（范围：0.12～25.00），中位MLR 值为0.34（范围：0.02～3.55），中位PNI 值为48.4（范围：29.5～61.9）。临床病理特征详见表1。

表1 137例肺腺癌患者的临床病理特征Table 1 Clinicopathological features of 137 patients with lung adenocarcinoma(N ＝137)

截至随访结束，有53例（38.7%）患者出现疾病进展，84例（61.3%）患者病情稳定或缓解，全组患者的中位PFS 时间为16.0 个月（1～51月），平均PFS 期为9.1 个月。

2.2 生存分析

2.2.1 单因素分析

应用log-rank 法进行单变量生存分析以确定与PFS 有关的临床特征，结果（表2）提示患者吸烟与否、治疗前转移器官个数、Ki-67增殖指数及γ-GGT 水平与PFS 期有关（P值均＜0.05），然而EGFR突变类型、年龄、性别、TKIs 药物类型及NLR、PLR、MLR、PNI 在预测PFS 方面，差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。

表2 肺腺癌患者的单因素生存分析Table 2 The univariate analysis of PFS in the patients with lung adenocarcinoma(N ＝137)

Kaplan-Meier 法分析结果显示，γ-GGT 值异常者的PFS 期为9.0 个月，短于γ-GGT 值正常者（17.0 个月）差异有统计学意义（P＝0.003）（图1）；Ki-67 增殖指数≤50%患者的中位PFS期为7.0 个月，明显短于Ki-67 增殖指数≥50%者（PFS 期为18.0 个月）（P＜0.001）（图1B）；仅有1 个器官转移与至少有2 个器官转移者的中位PFS 期分别为17.5 和10.0 个月（P＝0.008）（图1C）；不吸烟者的中位PFS 期为11.0 个月，不吸烟者的中位PFS 期为17.0 个月（P＝0.004），不吸烟者比吸烟者多6.0 个月（图1D）。

Fig.1 The association of γ-GGT expression level (A),Ki-67 index (B),number of organ metastasis (C)and smoking status (D) with PFS in 137 patients with lung adenocarcinoma.PFS:Progression-free survival;γ-GGT:Gamma-glutamyl transferase.图1 137例肺腺癌患者的γ-GGT 表达水平（A）、Ki-67 增殖指数（B）、器官转移个数（C）和吸烟状况（D）与PFS 的关系

2.2.2 多因素分析

把单因素生存分析结果里对患者PFS 有影响的指标γ-GGT、Ki-67 增殖指数、器官转移及吸烟史纳入COX多因素分析。结果（表3）显示，Ki-67 增殖指数、γ-GGT 和器官转移个数为独立的预后因素（P值均＜0.05）。

表3 137例肺腺癌患者预后的多因素分析Table 3 The multivariate analysis of progression-free survival (PFS) in 137 patients with lung adenocarcinoma

2.3 各指标与进展后T790M 的关系

137例患者中有53例患者出现疾病进展，其中有32例患者进行了二次组织活检行基因检测，19例（59.4%）患者发生T790M 突变阳性，13例（40.6%）患者为T790M 突变阴性。根据Fisher 确切概率法分析显示，年龄与T790M 突变状态有关（P＝0.029），差异有统计学意义（表4）；这一结果提示，在一代EGFR-TKIs 靶向治疗进展后的患者中，年龄＜65 岁的患者更可能发生T790M 突变。

表4 53例肺腺癌患者的临床病理特征与T790M 突变之间的关系Table 4 Relationship between clinicopathological features and T790M mutation in 53 patients with lung adenocarcinoma[n(%)]

3 讨论

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，最有效的治疗方法是手术[1]，然而，约70%的肺癌患者在诊断时已是局部晚期或发生转移，不适合手术治疗。近年来，靶向治疗的进展为晚期肺癌患者提供了新的治疗方案，尤其EGFR-TKIs 已被推荐作为具有EGFR敏感突变患者的一线治疗方案，与传统放化疗相比具有明显的疾病缓解率和生存优势。然而，患者接受EGFR-TKIs 治疗后往往出现耐药，PFS 仅为9～14 个月[4]。因此，早期预测患者靶向治疗预后，对于改善生存具有重要意义。在耐药患者中，有超过50%患者的耐药机制是因获得了T790M 突变，但由于组织活检为有创性操作，且T790M 检测具有假阴性，部分耐药患者因无足够的临床证据未能接受第三代EGFR-TKIs 靶向治疗，预后较差，因此探索T790M 突变相关影响因素具有重要意义。

本文回顾性分析了137例接受第一代EGFRTKIs 药物的晚期肺腺癌患者，单因素生存分析结果显示不同吸烟状况，治疗前转移器官数目，不同Ki-67 增殖指数和γ-GGT 水平均为患者预后的重要影响因素，其中吸烟、多发器官转移、高水平Ki-67 增殖指数和高水平γ-GGT 的患者预后差，这与先前的研究一致。COX多因素生存分析结果显示，器官转移数目、Ki-67 增殖指数和γ-GGT 是接受第一代EGFR-TKIs 的肺腺癌患者PFS 的独立预后因素。众所周知，不吸烟患者较吸烟患者更易发生EGFR突变[11]，而在EGFR敏感突变的晚期NSCLC 患者中，一项荟萃分析结果表明不吸烟患者的PFS 长于吸烟患者[12]，最常见的原因是非吸烟患者具有较高的EGFR突变率，在本研究中吸烟患者和不吸烟患者的中位PFS 分别为11 和17 个月，差异具有统计学意义，再次验证了EGFR-TKIs 靶向治疗在吸烟和不吸烟患者中具有不同的疗效，不吸烟患者在一线EGFR-TKIs 靶向治疗中具有更长的PFS。一项韩国研究结果表明，对于接受EGFR-TKIs 靶向治疗的晚期NSCLC 患者，非重度吸烟患者的PFS 比重度吸烟患者更好[13]，而本研究仅收集吸烟状态的数据，在以后的研究中可进一步收集吸烟时间和吸烟量来分析吸烟指数对预后的影响。Ki-67 增殖指数是目前评价肿瘤细胞增殖最可靠的免疫组织化学标志物，其蛋白表达水平和肿瘤恶性程度有关，在判断癌症的侵袭、转移及预后方面具有重要作用，有研究显示在亚洲早期肺腺癌患者中，Ki-67 高表达与总生存率及PFS 呈负相关[14]；ZHANG 等[15]研究结果提示，在接受EGFR-TKIs 靶向治疗的晚期肺腺癌患者中，较低的Ki-67 指数提示预后良好。本研究中发现，Ki-67 指数是晚期肺腺癌患者EGFR-TKIs 靶向治疗的独立预后因素，Ki-67 表达水平≥50%与表达水平＜50%患者的中位PFS 分别为7 和18 个月，差异具有明显的统计学意义，Ki-67 高表达者预后较差，这与先前研究结论一致。γ-GGT 是一种膜依赖性酶，主要来自肝脏，参与抗氧化剂谷胱甘肽的分解代谢，其促氧化和促炎特性被认为是导致不良疾病结局的病因机制。有研究表明，γ-GGT 与多种癌症患者生存预后呈负相关，如胰腺癌[16]、直肠癌[17]和卵巢癌[18]等。γ-GGT 在肺癌中的研究较少，BOZKAYA 等[19]发现，高血清γ-GGT 水平是转移性NSCLC 患者总生存期和PFS 的独立不良预后因素，但在该研究中排除了接受EGFR-TKIs 靶向治疗的患者。本研究中分析了γ-GGT 水平对晚期肺腺癌患者EGFRTKIs 靶向治疗疗效的影响，结果表明高水平γ-GGT 患者与低水平γ-GGT 患者的中位PFS 分别为9和17个月，差异具有统计学意义（P＝0.003），COX多因素分析结果提示，γ-GGT 水平是患者的独立预后因素（HR＝3.938，P＝0.001）。临床上常以58 U/L 来作为血清γ-GGT 正常水平的临界值，本研究以此为截断点，发现具有异常γ-GGT 水平的患者预后差，由于本研究在纳入患者时已排除肝转移者，因此结果具有较低偏差；且由于血清γ-GGT 是氧化应激的标志，一定程度上反映了肿瘤细胞的代谢状况，在预后癌症预后方面具有重要价值。

对第一代或第二代EGFR-TKIs 靶向治疗耐药的NSCLC 患者有半数发生耐药性T790M 突变[20]这一研究结果，本研究中对137例患者中有53例发生疾病进展，其中32例患者进行了二次基因测序，结果显示19例患者为T790M 突变阳性，突变率为59.4%，这与先前结果基本相符。另有研究表明，T790M 突变状态与L858R具有关联性[21]，而在本研究中，可能样本较少的原因，未发现T790M 突变状态与患者原突变类型的差异。但本研究中发现，患者年龄与T790M 突变状态相关（P＝0.029），差异有统计学意义。DAL MASO 等[22]针对高加索人群的研究发现，患者年龄与继发性T790M 突变阳性相关，年龄＜65 岁者更易发生T790M 突变。本研究中，基于中国人群得出了相同结论，即患者年龄与T790M 突变状况相关，年龄＜65 岁的患者T790M 突变率高于年龄≥65 岁的患者。然而一项基于日本人的研究结果表明，≥75 岁患者的耐药性T790M 突变率高于年轻患者[23]，该研究人群中位年龄为70 岁，而本研究人群中位年龄为59 岁，可能由于人群年龄的差异导致结果的不一致，这需要后续大样本量研究来探索年龄与耐药性T790M 突变的关系。本研究结果表明，年龄与T790M 突变状况相关，对于此类患者可推荐行第二次基因检测，或基因检测结果不理想的情况下推荐患者应用第三代TKIs 治疗。

尽管本研究结果表明，吸烟状态、Ki-67 增殖指数及γ-GGT 水平在接受一线EGFR-TKIs 靶向治疗的EGFR突变型肺腺癌患者中的预后价值，以及年龄与T790M 的相关性，但仍存在一定的局限性。首先，这是一个单中心回顾性研究，样本量相对较小，各组之间的不平衡可能会给结果带来一些偏差；其次，临界值与以前的研究不同，这使得很难将本研究结果与其他研究进行比较；研究仅收集了患者的PFS 资料，由于失访率较高，限制了本研究对总生存期资料的收集，在今后的研究中会扩大样本量，补充多总生存期影响的研究。由于该领域大多数研究为回顾性，因此仍需要更大样本量的多中心前瞻性研究来进一步验证吸烟状态、Ki-67 增殖指数及γ-GGT 水平在接受一线EGFR-TKIs 靶向治疗的肺腺癌患者中的预后价值，以及年龄对T790M 突变状况的影响。