微RNA-378a-3p靶向SUFU基因促进乳腺癌细胞的增殖和迁移

王嘉琳，高维强, ，方煜翔

WANG Jialin1 ,GAO Weiqiang1,2,FANG Yuxiang1

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，其世界范围内的发病率及死亡率分别位居第1 和第2位[1]；在中国，其发病率及死亡率分别位居第2和第5 位[2]，并且其发病率呈现逐年上升的趋势。

近年来，由于治疗方案的改进，如辅助化疗的推行，乳腺癌死亡率有所下降，但具有远处器官转移的晚期乳腺癌仍被认为是使用目前已知的治疗方法所难以治愈的[3]。因此，探索针对乳腺癌增殖、转移能力的有效治疗靶点对于疾病的诊治具有重要的意义。

微RNA（microRNA，miRNA，miR）是一种长度约为19～24 个核苷酸的非编码RNA，其通过与靶基因mRNA 的3’-端非翻译区（3’-untranslated regions，3’-UTR）进行完全或者不完全匹配在转录后水平上抑制靶基因的表达。已有的研究表明，在肿瘤中miRNA 可以通过调控其靶基因的表达发挥调控肿瘤细胞的增殖[4]、凋亡[5]、侵袭及转移[6]，起到促进或者抑制肿瘤发生和发展的作用。

目前为止，发生了他处器官转移的晚期乳腺癌仍然缺乏有效治疗方案。已有多项研究表明，miR-378a 在多种肿瘤（卵巢癌[7]、口腔鳞状细胞癌[8]、结直肠癌[9]、黑素瘤[10]、视网膜母细胞瘤[11]和前列腺癌[12]等）的发生与发展过程中，发挥着异质性的调控作用。YIN 等[13]发现，乳腺癌患者组织样本中miR-24 和miR-378 均呈过表达，提示miR-378 可能对于乳腺癌的发生和发展同样具有一定的调控作用；EICHNER 等[14]发现，miR-378-5p 在小鼠乳腺和人类乳腺癌细胞中能诱导“Warburg 效应”，指出miR-378-5p 表达与人类乳腺癌的进展有关。但在中国乳腺癌患者中miR-378a-3p 表达量与乳腺癌进展和预后等相关性鲜少有报道，因此探究miR-378a-3p 与乳腺癌发生和发展的相关性，以及分子机制对于治疗中国乳腺癌患者具有重要的临床意义。

本研究中首先构建了稳定过表达miR-378a-3p 或拮抗miR-378a-3p 表达的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231 细胞亚克隆；随后观察miR-378a-3p 表达量改变，对乳腺癌细胞增殖、抗凋亡及迁移能力的影响，并初步探究miR-378a-3p发挥促癌作用可能的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 从公共数据库中获取乳腺癌基因表达情况进行分析

通过使用在线软件Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot.com）获取GEO（Gene Expression Omnibus）（GSE19783）数据集（包括乳腺癌病例93例），利用Kaplan-Meier 法分析miR-378a 高表达（46例）和低表达组（47例）之间乳腺癌患者的生存情况并绘制生存曲线。使用在线软件Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）分析在乳腺癌样本中hsa-miR-378a-3p 与SUFU Hedgehog信号通路负调控子（SUFU negative regulator of Hedgehog signaling，SUFU）基因表达量的关系。

1.2 试剂和仪器

DMEM 培养液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Life Technologies 公司，TaqmanTMMiR Assay 试剂盒、RIPA Lysis and Extraction Buffer、PierceTMBCA Protein Assay试剂盒以及TRIzolTMReagent 试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司；PrimeScriptTM反转录试剂盒、实时荧光定量PCR SYBRGreen 试剂及Premix Ex TaqTM试剂盒购自日本TaKaRa公司。CCK-8 试剂盒购自大连美仑生物科技有限公司，Transwell 小室购自美国Corning 公司。兔抗人GAPDH（内参照）单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 购自美国Abclonal Technology 公司，兔抗人SUFU 多克隆抗体购自英国Abcam 公司，鼠抗人GLI 家族锌指1（GLI family zinc finger 1，GLI1）单克隆抗体购自美国Cell Signal Technology 公司，鼠抗人PTCH1 单克隆抗体购自美国GeneTex 公司；PVDF 膜以及电化学发光液购自美国Millipore 公司。限制性内切酶EcoR Ⅴ和NheⅠ购自美国New England Biolabs 公司。miR-378a-3p-模拟物（miR-378a-3p-mimics）和阴性对照（negative control，NC）-mimics，miR-378a-3p-抑制子（miR-378a-3pinhibitor）和NC-inhibitor 以及相应的重组慢病毒均购自吉满生物科技（上海）有限公司；miR-378a-3p-mimics 和NC-mimics 的序列分别为5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’和5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，miR-378a-3p-inhibitor 和NC-inhibitor 的序列分别 为5’-CCUUCUGACUCCAAGUCCAGU-3’和5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。转染试剂 LipofectAMINE 3000 购自美国Invitrogen 公司，双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega 公司，凋亡以及周期检测试剂购自翊圣生物科技（上海）有限公司，核质分离试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。双荧光素酶报告系统载体phEW-luc 由本实验室前期构建完成[15]，载体双酶切位点为EcoR Ⅴ和NheⅠ。Hedgehog 通路抑制剂环巴胺（cyclopamine）购自美国Selleck 公司[溶于乙醇溶液配制成储存液（浓度为5 mmol/L），工作液浓度为20 μmol/L]，Hedgehog 通路激活剂SAG（Smoothened Agonist）-HCl 购自美国Selleck公司[ 溶于DMSO 配制成储存液（浓度为10 mmol/L，工作液浓度为250 nmol/L）]。miR-378a-3p 的上游引物序列为5’-ACTGGACTTGGAGTCAGAAGGC-3’，下游引物序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA-3’；以人U6 基因为内参照，U6 基因的上游引物序列为5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，下游引物序列为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-378a-3p 以及U6 基因的引物购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。SUFU基因的上游引物序列 为5’-CACGCCATCTACGGAGAGTG-3’，下游引物序列为5’-GTACTTGACGATAGCGGTAACC-3’；以GAPDH基因内参照，GAPDH基因上游引物序列为5’-GGAAAGGAGGCACAAAGAAGC-3’，下游引物序列为5’-CCCCTTAGGCACTAGGAGC-3’；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

实时荧光定量PCR 仪为美国Thermo Fisher Scientific 公司产品；流式细胞仪（FACSAria Ⅱ）为美国BD 公司产品；ChemiDocTM成像系统为美国Bio-Rad 公司产品；多功能酶标仪Synergy HT 为美国BioTek 仪器有限公司产品；TS100倒置光学显微镜为日本Nikon 公司产品；双荧光素酶报告基因检测仪Junior LB 9509 为德国Berthold 公司产品。

1.3 细胞及其培养

人乳腺癌MDA-MB-231、BT549、SKBR3、T47D、MDA-MB-453、MCF-7 细胞和正常人乳腺上皮细胞MCF-10A，以及人胚胎肾细胞HEK-293T 均购自美国模式菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

所有细胞均用含10% FBS 的DMEM 完全培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的具有饱和湿度的培养箱中进行培养；待细胞密度达到90%时按照细胞与培养液的体积比为1 ∶（2～4）进行常规传代，收集处于对数生长期的细胞用于后续功能实验。

1.4 实时荧光定量PCR 检测乳腺癌细胞中miR-378a-3p 的表达水平

收集乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549、SK-BR3、T47D、MDA-MB-453 和MCF-7 以及乳腺上皮细胞MCF-10A。用TRIzol 试剂提取细胞总RNA，使用TaqMan MiR Assay 试剂盒将得到的总RNA 反转录为cDNA，再以此cDNA 为模板；加 入Premix ExTaqTM（Probe qPCR）试剂以及引物（miR-378a-3p 和内参照U6）进行实时荧光定量PCR 扩增；以2－ΔΔCt方法分析细胞内源性miR-378a-3p 的相对表达量。PCR 反应体系包括Premix Ex Taq 试剂10 μL、cDNA 模板 2 μL、miR-378a-3p 和U6 引物1 μL 以及无核酶的双蒸水7 μL。PCR 扩增条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，共40 个循环。

1.5 miR-378a-3p 过表达或抑制表达乳腺癌细胞的构建

MCF-7 和MDA-MB-231 细胞分别以1.5×105个的细胞数接种在6 孔板中，培养液中加入相关的慢病毒[感染复数（multiplicity of infection，MOI）＝10] 和10 μg/mL 的聚凝胺（polybrene）。在MCF-7 细胞中感染携带有miR-378a-3p-mimics 的重组慢病毒以及阴性对照NCmimics 重组慢病毒；在MDA-MB-231 细胞中感染携带有miR-378a-3p-inhibitor 的重组慢病毒以及阴性对照NC-inhibitor 重组慢病毒。病毒感染后24 h，将培养上清液替换为含10% FBS 的新鲜培养液，随后分别采用实时荧光定量PCR 检测miR-378a-3p 的表达水平。

1.6 CCK-8 法检测细胞增殖

收集处于对数生长期的各组细胞（miR-378a-3p 过表达的MCF-7 及其对照组细胞，抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-231 及其对照组细胞）分别接种于96 孔板中（2 000 个/孔），并设置只加培养液不接种细胞的空白对照组，每组设3个复孔。分别在细胞培养0、24、48、72、96 和120 h 时加入10 μL CCK-8 试剂，继续培养2 h 后，在酶联免疫检测仪波长450 nm 处检测各孔的D值，并绘制细胞生长曲线。

1.7 FCM 法检测细胞的凋亡率

收集处于对数生长期的各组细胞（分组同1.6节），以1×106个细胞的密度接种在6 孔板中，隔天待细胞状态稳定后消化细胞并使用预冷的PBS 洗涤细胞2 次。加入100 μL 1×结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μL FITC-Annexin Ⅴ和5 μL碘化丙锭（propidium iodide，PI），室温下避光染色15 min。最后，在每个离心管中加入400 μL 1×结合缓冲液后，上流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，利用FlowJo10 软件分析数据结果。

1.8 Transwell 小室法检测细胞的迁移能力

收集处于对数生长期的抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-231 细胞。将Transwell 小室置于24 孔培养板中，上层小室中接种150 μL 无血清细胞悬液（含5×104个细胞），下室加入500 μL 含10% FBS 的DMEM 培养液；将小室置于37 ℃培养箱中培养24 h 后，取出Transwell 小室，用棉签轻轻拭去微孔膜上未穿过小室膜的细胞；室温条件下用4%多聚甲醛溶液处理细胞15 min，PBS 洗涤3 次；随后用结晶紫染色液室温染色15 min，在光学显微镜观察细胞形态并计数穿过Transwell 小室膜的细胞数。

1.9 miR-378a-3p 靶基因双荧光素酶报告基因检测

使用在线软件TargetScan（htp:/www.targetscan.org）以及Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）检索人miR-378a-3p 的潜在靶基因。收集miR-378a-3p 过表达的MCF-7 细胞，采用实时荧光定量PCR 法检测和SUFU mRNA 的表达水平。细胞处理及实时荧光定量PCR 法检测流程同1.4 节。

采用SnapGene 软件与相关序列（SUFU mRNA 3’-UTR 的序列）进行比对，预测针对SUFU基因的2 个结合位点，由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成SUFU基因-野生型（wild type，WT）以及突变型（mutant type，MUT）片段。WT 片段包括2 个miR-378a-3p的结合位点T1 和T2，MUT 片段即对SUFU mRNA 的3’-UTR WT 与miR-378a-3p 的结合位点进行突变，分别命名为SUFU-WT1、SUFUWT2、SUFU-MUT1 和SUFU-MUT2。将合成的产物克隆到双荧光素酶报告系统载体上，分别命名为SUFU-T1WT、SUFU-T1MUT、SUFUT2WT 和SUFU-T2MUT。

采 用LipofectAMINE 3000 将miR-378a-3p-mimics、NC-mimics、SUFU-T1WT、SUFUT1MUT、SUFU-T2WT 和SUFU-T2MUT 经组合分别转入HEK-293T 细胞，行双荧光素酶报告系统检测。具体流程：在24 孔板中接种HEK-293T 细胞（5×104个/孔），待细胞完全贴壁后，取miR-378a-3p-mimics 和NC-mimics 各80 ng，Renilla质粒20 ng以及SUFU-T1WT、SUFUT1MUT、SUFU-T2WT、SUFU-T2MUT 质粒 各200 ng，分别与1 μL LipofectAMINE 3000TM和100 μL Opti-MEM 培养液混均 后进行转染。分组如下：SUFU-T1WT组（miR-378a-3p-mimics ＋Renilla ＋SUFU-T1WT）、SUFU-T1MUT组（NC-mimics ＋Renilla ＋SUFU-T1MUT）、SUFU-T2WT组（miR-378a-3p-mimics ＋Renilla ＋SUFU-T2WT）和SUFU-T2MUT（NC-mimics ＋Renilla+SUFUT2MUT）。细胞转染后置于37 ℃、CO2体积分数为5%的合适湿度的培养箱中培养48 h，用PBS 清洗细胞2 次，再每孔加入100 μL Passive Lysis Buffer（PLB）置于室温摇床上裂解细胞15 min，裂解完成后在试管中加入荧光素酶检测试剂Luciferase Assay Reagent Ⅱ（LAR Ⅱ）100 μL，再加入裂解液20 μL，吹打5～10 次后，放入双荧光素酶报告基因检测仪器内产生萤火虫荧光信号，定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop &Glo®试剂100 μL，轻柔混匀后，进行第2 次测量，定量海肾荧光强度。

1.10 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）法检测靶基因与下游目标分子的相互作用

收集处于对数生长期的乳腺癌细胞（miR-378a-3p 过表达的MCF-7 及其对照组细胞，抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-231 及其对照组细胞），每组细胞数为1×107个。用预冷的PBS洗涤细胞2 次，随后加入1 mL 预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液裂解细胞；收集细胞裂解液，14 000×g离心15 min，提取上清液。取100 μL 细胞裂解液作为Input（lysate）以备蛋白质印迹法检测，另取800 μL 上清液加入1 μg相应的抗体，4 ℃缓慢摇晃孵育过夜；次日每组样品取20 μL protein A/G 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次5 000×g离心3 min；然后将预处理后的20 μL protein A/G 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4 ℃缓慢摇晃孵育2～4 h，使抗体与proteinA/G 琼脂糖珠耦连；免疫沉淀反应之后，在4 ℃ 5 000×g离心3 min，除去上清液收集琼脂糖珠，用4 ℃预冷的1 mL 裂解缓冲液冲洗琼脂糖珠3～4 次；离心后吸去上清液，沉淀中加入20 μL 的2×SDS 上样缓冲液，置于100 ℃水浴中处理10 min 后即可进行后续蛋白质印迹法检测。

1.11 细胞质和细胞核蛋白的抽提

收集处于对数生长期的抑制miR-378a-3p表达的MDA-MB-231 及其对照组细胞（1×107个），将消化后的细胞及培养液移至离心管中，4 ℃ 500×g离心10 min，除去培养液，再向离心管中加入10 mL 预冷的1×PBS 缓冲液，4 ℃ 500×g离心5 min（重复2 次）；最后4 ℃1 000×g离心3 min 收集细胞，用移液枪尽可能吸去上清液；向体积为20 μL 的紧实细胞中加入200 μL 预冷的Buffer A（使用前每 1 mL Buffer A 中加入1 μL DTT，10 μL PMSF 和1 μL 蛋白酶抑制剂），涡旋剧烈振荡15 s，冰上静置10～15 min；加 入11 μL 预冷的Buffer B，涡旋剧烈振荡5 s，冰上静置15 s，再次涡旋剧烈振荡5 s；随后4 ℃ 14 000×g离心5 min，抽取上清液，即为抽提获得的细胞质蛋白，可长期保存于－80 ℃冰箱。用枪头伸入到离心管的底部，将最下层的液体吸出并丢弃，在白色细胞核沉淀物（细胞核）中加入100 μL预冷的Buffer C（使用前向每1 mL Buffer C 中加入1 μL DTT，10 μL PMSF 和1 μL 蛋白酶抑制剂），涡旋剧烈振荡10 s，置于摇床上冰浴处理40 min，150 次/min，再次振荡30 s，将混悬液于4 ℃ 14 000×g离心5 min，提取上清液即为细胞核蛋白，样品可保存于－80 ℃冰箱保存。

1.12 蛋白质印迹法检测相关基因的蛋白表达水平

用适量添加蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液加入已用预冷PBS 洗涤的培养皿中，将裂解后的细胞收集于1.5 mL EP 管中，置于冰上30 min，4 ℃ 14 000×g离心10 min，吸取上清液此即为细胞总蛋白。使用PierceTMBCA Protein Assay 试剂盒测定蛋白浓度。根据目的蛋白大小，行10% SDS-PAGE 分离蛋白（70～120 V的恒压条件下电泳90 min），随后在250 mA 的恒定电流（90 min）下将分离后的蛋白条带转移至PVDF 膜上。用含5% 脱脂牛奶的封闭液室温封闭PVDF 膜1 h 以上，然后加入适量兔抗人SUFU 多克隆抗体（体积稀释比例为 1 ∶1 000）、鼠抗人GLI1 单克隆抗体（体积稀释比例为 1 ∶1 000）和兔抗人GAPDH（内参照）单克隆抗体（体积稀释比例为 1 ∶2 000），以覆盖PVDF 膜即可，4 ℃反应过夜；次日用TBST洗膜3 次，5 min/次；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（体积稀释比例为 1 ∶5 000）或山羊抗鼠IgG（体积稀释比例为 1 ∶5 000），室温条件下反应1 h；再用TBST 洗膜3 次，5 min/次，用电化学发光剂处理后再用显影液显色，用化学发光仪成像记录实验结果。

1.13 评估Hedgehog 通路抑制剂环巴胺（cyclopamine）以及激活剂SAG（Smoothened Agonist）对乳腺细胞增殖、迁移、抗凋亡能力的影响

将miR-378a-3p 过表达的MCF-7 细胞以及对照组MCF-7 细胞在常规培养液中培养3 d 后加入Hedgehog 通路抑制剂环巴胺（终浓度20 μmol/L），以加入相同体积的溶剂乙醇溶液为对照，继续培养3 d（总培养时间为6 d）；再用CCK-8 法（实验流程同1.6 节）以及FCM 法（实验流程同1.7 节）检测细胞3 d 以及6 d 后的体外增殖能力以及抗凋亡能力。

将抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-231及其对照组细胞在常规培养液中培养3 d 后加入Hedgehog 通路激活剂SAG（终浓度250 nmol/L），以加入相同体积的溶剂DMSO 为对照，再用CCK-8 法（实验流程同1.6 节）以及Transwell小室法（实验流程同1.8 节）分析细胞3 d 以及6 d 时的体外增殖能力以及迁移能力。

1.14 统计学方法

采用GraphPadPrism 7 统计学软件对实验结果数据进行统计学分析。各实验均独立重复3次，计量资料结果数据以± s表示，多组间数据的比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，两独立样本间均数的比较采用t检验，生存曲线分析采用Kaplan-Meier 法，并使用log-rank 检验进行比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-378a-3p 表达与乳腺癌患者生存期相关且在乳腺癌细胞系中高表达

首先利用在线软件the Kaplan-Meier plotter 将GEO 数据集GSE19783 中人乳腺癌临床样本分为miR-378a-3p 高表达组（46例）和低表达组（47例），用于绘制生存曲线。结果显示（图1A），miR-378a-3p 高表达的乳腺癌患者总生存时间明显短于miR-378a 低表达的患者（P＝0.003 5）。这一结果提示，miR-378a对于乳腺癌具有一定的促癌作用。

为验证GEO 数据库的分析结果，进一步在6 株乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT549、SKBR3、T47D、MDA-MB-453、MCF-7 和正常乳腺上皮细胞系MCF-10A 中检测了内源miR-378a-3p 的表达量。实时荧光定量PCR 检测结果（图1B）显示，乳腺癌细胞系中miR-378a-3p 的表达量均明显高于正常乳腺上皮细胞（P值均＜0.001）。

根据这一结果，在后续实验中选取内源miR-378a-3p 表达水平最低的乳腺癌MCF-7 细胞构建过表达miR-378a-3p 的亚克隆；选取内源miR-378a-3p 表达水平最高的乳腺癌MDA-MB-231细胞构建拮抗miRNA 的亚克隆。进一步用于体外考察miRNA-378a-3p 对乳腺癌细胞增殖、抗凋亡及迁移的调控作用。

实时荧光定量PCR 检测结果显示，miR-378a-3p-mimics 能明显上调MCF-7细胞中miR-378a-3p 的表达水平（P＜0.001，图1C），miR-378a-3p-inhibitor 能明显抑制MDA-MB-231 细胞中miR-378a-3p 的表达水平（P＜0.001，图1D）。

Fig.1 The correlation between microRNA (miR)-378a-3p expression and prognosis of breast cancer patients was analyzed by Kaplan-Meier method [date from Gene Expression Omnibus (GEO) database](A),the expression levels of miR-378a-3p in different breast cancer cells (MDA-MB-231,BT549,SK-BR3,T47D,MDA-MB-453 and MCF-7 cells) and normal breast epithelial cell MCF-10A (as the control) were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (B),and the expression levels of miR-378a-3p in breast cancer MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying miR-378a-3p-mimics (C) and MDAMB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying miR-378a-3p-inhibitor (D) were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-mimics and MDA-MB-231 cells infected with NC-inhibitor were taken as the controls.***P<0.001,****P<0.000 1 (n=3).图1 利用GEO 数据库分析miR-378a-3p 表达与乳腺癌患者预后的相关性，以及实时荧光定量PCR 检测miR-378a-3p 在不同的乳腺癌细胞中的表达水平

2.2 过表达或抑制miR-378a-3p 表达对乳腺癌细胞体外增殖的影响

采用CCK-8 法检测过表达miR-378a-3p 对MCF-7 细胞增殖能力的影响。结果（图2A）显示，过表达miR-378a-3p 后，MCF-7 细胞的增殖活性明显增强（P＜0.000 1）；细胞培养3～5 d 时与对照组相比，差异均有统计学意义（第3 天时P＝0.037 3；第4 天时P＝0.000 1；第5 天时P＜0.000 1）。

同时，采用CCK-8 法检测抑制miR-378a-3p 表达对MDA-MB-231 细胞增殖能力的影响。结果（图2B）显示，抑制miR-378a-3p表达后MDA-MB-231 细胞增殖活性明显降低（P＜0.000 1），第2 天～第5 天时与对照组相比，差异均有统计学意义（P值均＜0.000 1）。

2.3 过表达miR-378a-3p 可促进乳腺癌细胞的抗凋亡

采用FCM 法检测过表达miR-378a-3p 对MCF-7 细胞凋亡率的影响。结果（图3A）显示，过表达miR-378a-3p 后，MCF-7 细胞的凋亡率由对照组的（4.60±0.37）%下降到（2.70±0.14）%；与对照组相比，MCF-7 细胞的凋亡率明显降低（P＜0.01）。这一结果提示，在MCF-7 细胞中过表达miR-378a-3p 能抑制其抗凋亡能力。

同时，采用FCM 法检测抑制miR-378a-3p表达对MDA-MB-231 细胞凋亡率的影响。结果（图3B）显示，miR-378a-3p-inhibitor组MDAMB-231 细胞的凋亡率为（2.01±0.08）%，对照组MDA-MB-231 细胞的凋亡率为（1.24±0.20）%；与对照相比，抑制miR-378a-3p 表达后MDAMB-231 细胞的凋亡率明显上升（P＜0.05）。这一结果提示，在MDA-MB-231 细胞中拮抗miR-378a-3p 表达能增强其抗凋亡能力。

Fig.2 The proliferation abilities of breast cancer MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying microRNA (miR)-378a-3p-mimics (miR-378a-3p overexpression) (A) and MDA-MB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying miR-378a-3p-inhibitor (silencing miR-378a-3p expression)(B) were detected by CCK-8 assay.MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-mimics and MDA-MB-231 cells infected with NC-inhibitor were taken as the controls.*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1,vs the controls (n=3).图2 CCK-8 法检测过表达miR-378a-3p 或抑制miR-378a-3p 表达对乳腺癌MCF-7 细胞（A）和MDAMB-231 细胞（B）增殖能力的影响

Fig.3 The apoptosis rates of breast cancer MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying microRNA (miR)-378a-3p-mimics (miR-378a-3p overexpression) (A) and MDA-MB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying miR-378a-3p-inhibitor (silencing miR-378a-3p expression) (B) were detected by FCM.MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-mimics and MDA-MB-231 cells infected with NC-inhibitor were taken as the controls.*P<0.05,**P<0.01 (n=3).图3 FCM 法检测上调或抑制miR-378a-3p 表达对乳腺癌MCF-7（A）和MDA-MB-231 细胞（B）凋亡率的影响

2.4 抑制miR-378a-3p 表达可抑制乳腺癌MDAMB-231 细胞的迁移能力

采用Transwell 小室实验检测拮抗miR-378a-3p 表达水平对对MDA-MB-231 细胞体外迁移能力的影响。结果（图4）显示，在MDAMB-231 细胞中抑制miR-378a-3p 表达后能明显减弱细胞迁移能力。与对照组相比，抑制miR-378a-3p 表达后，发生体外迁移的肿瘤细胞数量从（1 061.00± 64.79）个减少至（261.00±53.82）个（P＜0.001）。

2.5 乳腺癌细胞中miR-378a-3p 高表达抑制靶基因SUFU 表达

通过生物信息学分析（在线软件TargetScan以及Starbase）筛选hsa-miR-378a-3p 的潜在靶基因，结果发现人SUFU mRNA 的3’-UTR 中含有2 个miR-378a-3p的识别结合位点（图5A）。

在此基础上，采用实时荧光定量PCR 和蛋白质印迹法检测miR-378a-3p 过表达MCF-7细胞中SUFU mRNA 和蛋白的表达水平。结果（图5B）显示，MCF-7 细胞中过表达miR-378a-3p 后，SUFU mRNA 和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01)。以上结果提示，在乳腺癌细胞中SUFU基因可能受到miR-378a-3p 的靶向调控。

进一步通过双荧光素酶报告基因系统分别对SUFU mRNA 3’-UTR 上的2 个预测结合位点进行验证。双荧光素酶报告基因系统检测结果（图5C）显示，miR-378a-3p 主要与SUFU mRNA 3’-UTR 中的T1 结合位点结合，在MCF-7 细胞中在转染了内参Renilla luciferase 报告质粒的前提下，同时转染miR-378a-3p-mimics 与SUFUT1WT 质粒（包含SUFU mRNA 3’-UTR 中的第一个结合位点的野生型序列）时其双荧光素酶报告系统比值（R1/R2）明显减低（P＜0.000 1），同时转染miR-378a-3p-mimics 与包含该位点突变型序列的SUFU-T1MUT 质粒时R1/R2 均未出现明显降低（P＝0.284 3）。此外对于预测的第2 个结合位点，miR-378a-3p-mimics 无论与包含该位点野生型序列的SUFU-T2WT 质粒（P＝0.200 2）或突变型序列的SUFU-T2MUT 质粒共转染双荧光素酶报告系统比值（R1/R2），差异均未有统计学意义（P＝0.4700）。

另外，通过在线软件Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）对1 085例乳腺癌样本分析后发现（图5D），SUFU mRNA 的表达水平与miR-378a-3p的表达水平呈负相关（P＝1.02×10－4）[16]。上述结果均提示，miR-378a-3p 可以在转录后水平上调控SUFU基因的表达。

2.6 miR-378a-3p 通过影响SUFU 与GLI1 结合以及影响GLI1 转入细胞核激活Hedgehog 信号通路而发挥促癌作用

Fig.4 The migration ability of breast cancer MDA-MB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying microRNA (miR)-378a-3p-inhibitor (silencing miR-378a-3p expression) was detected by Transwell assay (crystal violetstaining,×100).MDA-MB-231 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-inhibitor were taken as the control.***P<0.001 (n=3).图4 Transwell 小室法检测抑制miR-378a-3p 表达对乳腺癌MDA-MB-231 细胞迁移能力的影响

Fig.5 SUFU was the target gene of microRNA (miR)-378a-3p in breast cancer cells.A:The potential binding sites of miR-378a-3p in SUFU mRNA 3’-untranslated region (3’-UTR) were analyzed by bioinformatics assay.B:The effects of miR-378a-3p overexpression on the expression levels of SUFU mRNA and protein in breast cancer MCF-7 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting,respectively.C:The dual luciferase reporter system was used to verify the binding of miR-378a-3p on binding sites of the SUFU mRNA 3’-UTR [****P<0.000 1 (n=3)].D:The expression of miR-378a-3p was negatively associated with SUFU expression in breast cancer cells by bioinformatics assay.NC:Negative control.图5 在乳腺癌细胞中，SUFU 是miR-378a-3p 的靶基因

已有的研究表明，SUFU 是Hedgehog 信号通路的负调控子，可以通过与GLI1 相互作用阻止其转入细胞核从而抑制GLI1 的功能[17]。而Hedgehog 信号通路是已知的在多种肿瘤中调控肿瘤细胞增殖及转移的一条重要的信号通路[18]。因此，结合上述实验结果及相关研究报道，推测在乳腺癌中miR-378a-3p 可通过抑制SUFU 的表达间接促进GLI1 转入细胞核，从而激活Hedgehog信号通路，发挥促进乳腺癌细胞体外增殖、抗凋亡和迁移的作用。

为了验证这一推测，本研究中首先采用蛋白质印迹法检测了Hedgehog 信号通路中重要的组成分子GLI1 和PTCH1 蛋白的表达水平，结果（图6A）显示，miR-378a-3p 过表达的MCF-7 细胞中GLI1 和PTCH1 蛋白表达上调；这一结果提示，过表达miR-378a-3p 可激活Hedgehog 信号通路。

通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）进一步验证miR-378a-3p 过表达的MCF-7 及其对照组细胞，抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-231 及其对照组细胞中SUFU 与GLI1 蛋白的相互作用。CO-IP 法检测结果（图6B）显示，过表达miR-378a-3p 的MCF-7 中通过抑制SUFU 表达削弱了SUFU 与GLI1 蛋白的结合，而拮抗miR-378a-3p 表达的MDAMB-231 细胞中SUFU 蛋白表达水平上调，巩固了SUFU 与GLI1 蛋白的结合，阻碍GLI1 蛋白转入细胞核。

Fig.6 The effects of microRNA (miR)-378a-3p on the interaction of SUFU negative regulator of hedgehog signaling (SUFU) and GLI family zinc finger 1 (GLI1) and the distribution of GLI1 in the nucleus and cytoplasm.A:The effects of miR-378a-3p overexpression on the expression levels of PTCH1 and GLI1 proteins in breast carcer MCF-7 cells were detected by Western blotting.B:The influence of miR-378a-3p on the interaction between SUFU and GLI1 in MCF-7 and MDAMB-231 cells was detected by co-immunoprecipitation (co-IP) assay.C:The distribution of SUFU and GLI1 proteins in the nucleus and cytoplasm of MDA-MB-231 cells after silencing miR-378a-3p expression was detected by Western blotting.MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-mimics and MDA-MB-231 cells infected with NC-inhibitor were taken as the controls.图6 miR-378a-3p 对SUFU 与GLI1 的结合以及GLI1 在细胞质和细胞核中分布的影响

随后选择抑制miR-378a-3p 表达的MDAMB-231 细胞，分别提取细胞质及细胞核中的蛋白，采用蛋白质印迹法进一步验证GLI1 以及SUFU 蛋白定位的变化。检测结果（图6C）提示，抑制miR-378a-3p 表达后SUFU 的表达水平提高，从而使SUFU 与GLI1 蛋白的结合增强，导致GLI1 囤积在细胞质中，使得细胞核中GLI1 蛋白的表达量明显减少。上述结果提示了，抑制miR-378a-3p 表达具有一定的抑制Hedgehog 信号通路活性的作用。

2.7 miR-378a-3p 在乳腺癌细胞中高表达通过激活Hedgehog 信号通路发挥促癌功能

上述研究提示，miR-378a-3p 过表达时乳腺癌细胞中Hedgehog 信号通路被激活。同时进一步探讨miR-378a-3p 表达水平的改变是否为通过改变Hedgehog 信号通路活性调控乳腺癌细胞的增殖、抗凋亡和迁移能力。常规培养3 d 后进行CCK-8 检测，结果显示miR-378a-3p 过表达MCF-7 细胞的增殖能力明显强于NC-mimics组（P＜0.000 1）；加 入cyclopamine（20 μmol/L）后继续培养3 d，再次用CCK-8 法检测发现，无论是miR-378a-3p-mimics组还是NC-mimics组，与NC-mimics ＋乙醇组的MCF-7 细胞相比，细胞增殖能力均明显下降，提示抑制Hedgehog 信号通路活性可抑制乳腺癌细胞的增殖；且miR-378a-3p-mimics ＋cyclopamine组MCF-7细胞与NC-mimics ＋乙醇组的增殖能力相当（P＝0.223 6）（图7A）。这一结果提示了，过表达miR-378a-3p 对肿瘤细胞的促增殖作用可通过抑制其下游的Hedgehog 信号通路活性予以抵消，也暗示了过表达miR-378a-3p 可能是通过调控下游的Hedgehog 信号通路发挥促肿瘤细胞增殖的作用。

Fig.7 The cell viabilities of MCF-7 cells with microRNA (miR)-378a-3p overexpression after treatment with Hedgehog signaling pathway inhibitor cyclopamine (20 μmol/L) (A) and MDA-MB-231 cells with miR-378a-3p down-regulation after treatment with Hedgehog signaling pathway activator (SAG:250 μmol/L) (B) were detected by CCK-8 method.****P<0.000 1 (n=3).NC:Negative control.图7 CCK-8 法检测miR-378a-3p 过表达的MCF-7 细胞经Hedgehog 信号通路抑制剂cyclopamine（20 μmol/L）处理后（A）其细胞活力的变化，以及抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-231 细胞经Hedgehog 信号通路激动剂SAG（250 mol/L）处理后（B）其细胞活力的变化

为了进一步验证这一推论，本研究中将抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-453 细胞使用CCK-8 法在上述实验相同的时间点进行检测，同样获得了类似的结果，即无论是否拮抗miR-378a-3p 的表达水平，Hedgehog 通路激活剂SAG 均可促进乳腺癌细胞的增殖（P＜0.00 0 1），而加入SAG处理3 d 后miR-378a-3p-inhibitor组MDA-MB-231 细胞的增殖能力与加入溶剂DMSO 的NC-inhibitor组MDA-MB-231细胞的增殖能力持平（P＝0.902 9）（图7B）。上述结果均提示了，miR-378a-3p 可以通过调控下游的Hedgehog 信号通路调控乳腺癌细胞的增殖。

此外，本研究中同样考察了miR-378a-3p 表达改变能否通过Hedgehog 信号通路调控乳腺癌细胞的抗凋亡能力。结果（图8）显示，无论是否过表达miR-378a-3p，加入cyclopamine 后发生凋亡的细胞数量明显增加。同时，细胞培养3 d再加入cyclopamine 后，其发生凋亡的细胞数量与NC-mimics ＋乙醇组发生凋亡的细胞数量接近（P＝0.329 1），提示了通过过表达miR-378a-3p产生的抗凋亡作用在抑制了Hedgehog 信号通路后被削弱了，说明过表达miR-378a-3p 可通过激活miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信号通路发挥抗凋亡的作用。

同样地，通过Transwell 小室实验检测在抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-231 细胞中加入Hedgehog 通路激活剂SAG 后能否恢复肿瘤细胞的体外迁移能力。结果（图9）显示，无论是否抑制miR-378a-3p 表达，加入SAG 后发生迁移的细胞数量明显著增加（P＜0.05）。类似地，在第3 天时miR-378a-3p-inhibitor ＋SAG组细胞发生迁移的细胞数量与NC-inhibitor ＋DMSO组相比差异无统计学意义（P＝0.521 7）。下调miR-378a-3p 表达后可通过抑制miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信号通路的活性抑制肿瘤细胞的迁移能力。

以上这些实验结果均表明miR-378a-3p 在乳腺癌细胞中高表达可通过激活miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信号通路促进肿瘤细胞的增殖、抗凋亡及迁移，进而发挥促进肿瘤发展的作用。

Fig.8 The apoptosis rate of MCF-7 cells with microRNA (miR)-378a-3p overexpression after treatment with Hedgehog signaling pathway inhibitor cyclopamine (20 μmol/L) was detected by FCM.*P<0.05,***P<0.00 1,****P<0.000 1 (n=3).NC:Negative control.图8 FCM 检测miR-378a-3p 过表达MCF-7 细胞经Hedgehog 信号通路抑制剂cyclopamine（20 μmol/L）处理后对其凋亡率的影响

Fig.9 The cell migration ability of MDA-MB-231 cells with microRNA (miR)-378a-3p downregulation after treatment with Hedgehog signaling pathway activator (SAG:250 nmol/L)was detected by Transwell assay (crystal violetstaining,×100).*P<0.05,**P<0.01 (n=3).NC:Negative control.图9 Transwell 小室实验检测抑制miR-378a-3p 表达的MDA-MB-231 细胞经Hedgehog 信号通路激动剂SAG（250 μmol/L）处理后其细胞迁移能力的变化

3 讨论

远端器官的转移是晚期乳腺癌高致死率的重要原因之一[3]。已有的研究表明，miR 可以通过调控多种肿瘤增殖转移相关信号通路，如Hedgehog 信号通路、Wnt 信号通路等发挥促进肿瘤生长转移的作用[19]。已有的报道显示，miR-378 家族在临床乳腺癌组织中表达上调，并提示其可能与肿瘤的发展相关[13]。本课题组前期研究中也发现，miR-378 可促进肾癌细胞的增殖和迁移[20]。在本研究中发现，miR-378 家族成员之一的miR-378a-3p 表达量在乳腺癌细胞系中均显着增加。miR-378a-3p 高表达的乳腺癌患者生存率明显低于低表达患者，提示了miR-378a-3p 可能在乳腺癌发展过程中发挥一定的促癌作用。通过相关的体外细胞学实验及分子机制探究，发现miR-378a-3p 高表达可通过miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信号通路诱导乳腺癌细胞的增殖、抗凋亡和迁移能力的增强。

本研究中筛选并鉴定发现，SUFU基因是miR-378a-3p 得以在乳腺癌中发挥促癌作用的直接下游靶标。miR-378a-3p 通过与SUFU mRNA 3’-UTR 区域结合在转录后水平上抑制其表达。与本研究发现一致，SUFU已在多种肿瘤中被报道是一种抑癌基因[21]。例如PENG 等[22]研究发现，SUFU基因在临床胃癌组织样本和胃癌细胞系中表达下调，发挥抑癌作用；MIA 等[23]发现，SUFU基因同样在膀胱癌中发挥抑癌作用。本研究结果提示，SUFU作为miR-378a-3p 重要靶基因，可以成为乳腺癌治疗中的一个潜在的治疗靶点。

已有的研究表明，Hedgehog 信号通路及其上游调控因子的失调是肿瘤发生和发展的重要调控机制[24]，SUFU 作为Hedgehog 信号通路中重要组成分子，为转录因子GLI 的负调节因子，对Hedgehog 信号通路起负调控作用[25]。SUFU 通过与GLI1/2 蛋白结合阻止其激活以及向细胞核中定位[26]。已有的报道显示，锂可通过抑制糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）阻止SUFU/GLI1 复合物解离，以此阻止GLI1 向细胞核的转运[17]，导致Hedgehog信号通路的失调，诱导胰腺导管腺癌的发生。在本研究中同样证实，miR-378a-3p 高表达可通过抑制SUFU 表达削弱SUFU 与GLI1 的结合，从而将GLI1 从该复合物中释放出来，以此加强了GLI1 在细胞核内的定位。另一方面，在乳腺癌细胞系中通过外源过表达miR-378a-3p 获得的促进增殖、迁移及抗凋亡的表型在阻断Hedgehog信号通路后可削弱相应表型。反之亦然，外源拮抗miR-378a-3p 的表达水平带来的抑癌效果可通过激活Hedgehog 信号通路予以抵消。这些数据表明，高表达的miR-378a-3p 通过负调控SUFU激活Hedgehog 信号通路发挥促癌作用。因此，本研究结果提示通过拮抗miR-378a-3p 的表达水平，联合Hedgehog 信号通路抑制剂或可成为一种全新的乳腺癌辅助治疗策略。

综上所述，本研究结果证明了miR-378a-3p/SUFU/Hedgehog 信号通路轴促进了乳腺癌细胞的生长、抗凋亡和侵袭且在临床上与不良预后有关。因此，靶向miR-378a-3p 通过降低其表达量或封闭其功能以此抑制肿瘤细胞的生长和侵袭对于治疗晚期乳腺癌患者，可能是一种行之有效的辅助疗法。