miR-409-3p靶向调控MTF2基因在鼻咽癌细胞紫杉醇耐药机制中的作用

肖 剑，陈亦龙，谭国林，宋业勋

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是我国南方各个省份及东南亚地区最常见的头颈部恶性肿瘤之一。大部分患者发现时已经是中晚期[1]，单纯放疗效果欠佳，以放疗为主、化疗为辅的综合治疗是中晚期鼻咽癌患者的首选治疗策略[2]。然而，临床上往往出现的化疗耐药现象，显著降低了鼻咽癌患者的总体生存率。紫杉醇（Taxol）在鼻咽癌的治疗中应用最为广泛，因此深入阐明紫杉醇的耐药机制具有重要意义。

微RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类短的、高度保守的内源非编码 RNA（长度为19～25 个核苷酸），通过与靶标基因mRNA 的3’-非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）结合而参与基因表达的转录后调控[3]。miRNA 已被证明是解决不同恶性肿瘤中化学耐药机制的有前途的治疗靶点[4]。此外，研究表明特定miRNA的表达与抗癌药物耐药性的发展有关[5]。已有研究表明，miR-409-3p 在不同的肿瘤组织中既可能发挥抑癌作用，又可能发挥促癌作用，甚至当同一肿瘤处于生长期的不同阶段时，miR-409-3p 在其中发挥的作用可能相反[6-9]。

目前有关miR-409-3p 在鼻咽癌耐药中可能发挥的作用尚不清楚，因此本研究旨在探讨miR-409-3p 与其靶基因MTF2 的调控关系，以及在鼻咽癌紫杉醇耐药中的作用机制，以期为鼻咽癌化疗耐药逆转提供一条新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器

鼻咽癌亲本细胞株CNE-1 和5-8F 由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所惠赠，对紫杉醇耐药的细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 由本科室研究团队前期用紫杉醇作为诱导剂，在体外以药物大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法作用于人鼻咽癌细胞株构建获得[10]。

胎牛血清及RPMI 1640 培养液购自美国Gibco 公司，紫杉醇注射液购自成都曼斯特生物科技有限公司，CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，TRIzol 试剂及反转录试剂盒购自美国Invitrogen 公司。miR-409-3p-抑制子（miR-409-3p-inhibitor）和阴性对照（negative control，NC）-inhibitor 以及实时荧光定量PCR试剂盒qRT-PCR Starter Kit 购自广州锐博生物科技有限公司。miR-409-3p-模拟物（miR-409-3p-mimics）和NC-mimics、携带有MTF2 全基因的重组质粒pcDNA3.1-MTF2 和阴性对照pcDNA3.1-NC 购自上海吉凯基因化学技术公司；携带有野生型（wild type，WT）MTF2-3’-UTR（MTF2-WT）和突变型（mutant type，MUT）MTF2-3’-UTR（MTF2-MUT）的肾素荧光素酶报告质粒购自上海锐赛生物技术有限公司。兔抗人MTF2 单克隆抗体和GAPDH（内参照）单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG 购自美国Licor 公司，蛋白预染指示剂Marker 购自美国Fermentas 公司，一抗和二抗稀释液购自上海翊圣生物科技有限公司。Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒购自美国eBioscience 公司，Lipofect AMINE 3000 购自上海锐赛生物技术有限公司。

倒置光学显微镜为日本Olympus 公司产品，Novo-Cyte 流式细胞仪为美国ACEA 公司产品，电泳仪为美国Bio-Rad 公司产品，Mastercycle gradient PCR 仪为德国Eppendorf 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

鼻咽癌亲本细胞（CNE-1 和5-8F）和鼻咽癌紫杉醇耐药细胞（CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol）培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培养液中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中进行培养，待细胞长满培养瓶底部或细胞融合度＞80%后传代，取对数期、生长状况良好的细胞进行后续实验。

1.2.2 平板克隆实验及CCK-8 法检测鼻咽癌亲本细胞及紫杉醇耐药细胞对紫杉醇的敏感性

平板克隆实验：收集鼻咽癌亲本细胞株CNE-1 和5-8F 以及紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol，用培养液将细胞密度调整为333 个/mL，6 孔板中每孔均匀接种1.5 mL 细胞悬液；待细胞贴壁后每组细胞中加入不同浓度梯度的紫杉醇溶液（0、0.5、1、2、3、4、8 和12 nmol/L）进行处理，24 h 后撤掉紫杉醇溶液，加入新的完全培养液，继续在培养箱中培养1 周左右；最后每孔中加入4%多聚甲醛溶液固定细胞15 min，再加入适量的结晶紫染色液将细胞染色10～15 min。将6 孔板置于低倍显微镜下计数＞10 个细胞的克隆数。计算克隆形成率并绘制平板克隆折线图，克隆形成率（%）＝克隆数/接种细胞数×100%。

CCK-8 法检测：收集4组细胞，将细胞悬液的密度调整为4×104个/mL，以每孔100 μL的细胞数均匀加入96 孔板中（其中空白组不接种细胞）；每个孔中加入不同浓度的紫杉醇溶液（0、0.5、1、2、3、4、8 和12 nmol/L）（其 中空白组和对照组不加紫杉醇溶液，每个浓度梯度设置5 个复孔），将96 孔培养板置于培养箱中培养48 h 后，吸除旧培养液；每孔中加入100 μL CCK-8 溶液（按1 ∶10 的体积比例配制），放入培养箱中继续培养40～60 min，最后在免疫酶标仪波长450 nm 处检测各孔细胞的D值，使用Graphpad Prism 7 软件计算细胞存活率和紫杉醇对各株细胞的半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值。

1.2.3 实时荧光定量PCR 检测miR-409-3p 在鼻咽癌亲本细胞株及紫杉醇耐药细胞株之间的表达差异

收集鼻咽癌亲本细胞株CNE-1 和5-8F 及紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol，加入TRIzol 试剂，裂解提取细胞总RNA，并反转录为cDNA；取2 μL 制备获得的cDNA 进行PCR 扩增：95 ℃预变性10 min，之后进行40 个循环（95 ℃变性2 s、60 ℃退火20 s、70 ℃延伸10 s）。引物序列：miR-409-3p 上游引物序列为5’-GCGAATGTTGCTCGGTGAG-3’，下 游引物序列为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；内参照U6 上游引物序列为5’-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3’，下游引物序列为5’-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3’；MTF2 基因上游引物序列为5’-CTGGGATAGATTGCACCCTG-3’，下游引物序列为5’-ATTCGCAACCCAAACAAATGC-3’；内参照GAPDH基因上游引物序列为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.4 细胞转染

将鼻咽癌紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 接种于6 孔板中，置于培养箱中培养，使用LipofectAMINE 3000 转染试剂将miR-409-3p-inhibitor 和对照NC-inhibitor 分别转入紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中，转染流程见试剂盒提供的操作说明；采用实时荧光定量PCR 法检测转染效率，实验流程同1.2.3 节，并用平板克隆实验及CCK-8 法检测抑制miR-409-3p 表达后的耐药细胞对紫杉醇敏感性的变化，实验流程同1.2.2 节。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验检测miR-409-3p和MTF2 基因的相关性

通 过Targetscan、miRDB、miRTarBase 和miRWalk 数据库分别预测miR-409-3p 可能的下游靶基因，初步筛选miR-409-3p 的下游靶基因可能是MTF2。

将miR-409-3p-mimics、NC-mimics 与携带有MTF2-WT 和MTF2-MUT 的重组肾素荧光素酶报告质粒两两组合后共转染5-8F 细胞，转染方法同1.2.4 节；转染48 h 后使用裂解缓冲液裂解细胞，然后记录检测数据。采用双荧光素酶报告系统分析荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶活性作为内控参照。

1.2.6 实时荧光定量PCR 和蛋白质印迹法检测抑制miR-409-3p 表达后对MTF2 mRNA 及蛋白质表达水平的影响，及MTF2 在鼻咽癌亲本细胞株及紫杉醇耐药细胞株的表达差异

将miR-409-3p-inhibitor 和NC-inhibitor分别转入紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol中，转染流程见试剂盒提供的操作说明；实验分为4组：5-8F/Taxol ＋miR-409-3p-inhibitor组、5-8F/Taxol ＋NC-inhibitor组、CNE-1/Taxol ＋miR-409-3p-inhibitor组、CNE-1/Taxol ＋NC-inhibitor组，行实时荧光定量PCR 检测抑制miR-409-3p对靶基因MTF2 mRNA 表达水平的影响，并检测MTF2 mRNA 在鼻咽癌亲本细胞和紫杉醇耐药细胞中的表达差异，实验流程同1.2.3 节。

同时行蛋白质印迹法检测。收集上述各组细胞，加入胰蛋白酶消化后，用PBS 缓冲液清洗细胞3 次；加入RIPA 裂解液，收集细胞上清液，行SDS-PAGE 分离蛋白；电泳结束后将分离后的蛋白转移至PVDF 膜上；将转移膜置于摇床上用含5%牛血清白蛋白的封闭液封闭处理1 h；加入一抗[兔抗人MTF2 单克隆抗体（体积稀释比例为1 ∶1 000）和GAPDH（内参照）单克隆抗体（体积稀释比例为1 ∶3000）]，4 ℃轻摇过夜；加入二抗[HRP 标记的山羊抗兔IgG（体积稀释比例为1 ∶15 000）]，室温孵育1 h。二抗孵育完成后行荧光成像。

1.2.7 集落形成实验及CCK-8 法检测过表达MTF2 后的耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol对紫杉醇敏感性的变化

收集对数生长期的5-8F/Taxol 细胞和CNE-1/Taxol 细胞，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，接种于6 孔板中（500/孔），24 h 后分别 将pcDNA3.1-MTF2 和pcDNA3.1-NC转入5-8F/Taxol 细胞和CNE-1/Taxol 细胞，转染流程参阅试剂盒提供的操作说明。采用平板克隆实验及CCK-8 法检测过表达MTF2 后的耐药细胞对紫杉醇敏感性的变化，实验流程同1.2.2 节。

1.2.8 FCM 法检测

收集转染6 h 后的5-8F/Taxol 细胞和过表达MTF2 的5-8F/Taxol 细胞，加入终浓度为2 nmol/L 的紫杉醇溶液处理48 h。采用AnnexinⅤ-FITC/PI 试剂盒染色5～15 min 后，上流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.2.9 统计学方法

应用SPSS 17.0 统计学软件对获得的数据进行统计学分析。所有的实验均独立重复3 次，实验数据用± s表示。对于两组间的均数的差异性检验应用两独立样本t检验或者是两配对样本的t检验来进行统计学分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌亲本细胞及紫杉醇耐药细胞株对紫杉醇的敏感性

分别采用CCK-8 法和集落形成实验检测不同浓度的紫杉醇对鼻咽癌亲本细胞CNE-1 和5-8F 及其对紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 增殖能力的影响，并计算IC50值。结果（图1）显示，紫杉醇对亲本细胞5-8F 和CNE-1 的IC50值分别为（0.54±0.63）nmol/L和（1.02±0.41）nmol/L，对耐药细胞5-8F/Taxol 和CNE-1/Taxol 的IC50值分别为（7.04±0.43）nmol/L 和（8.52±0.56）nmol/L；与亲本细胞相比，紫杉醇耐药细胞株对紫杉醇的IC50值均明显提高，差异有统计学意义（P值均＜0.05）。

有学者对无人驾驶时代进行了展望，“从长远趋势来看，无人驾驶普及后，交通拥堵的现象会大幅下降，车祸等问题也会相应缓解——有研究表明，当前90%以上的车祸都是人为因素引起的。”[10]谷歌研制无人驾驶汽车的动机与出发点就是降低交通事故的发生率，至于无人驾驶时代，是否就消灭了道路交通违法犯罪，难以预料。2016年2月14日谷歌无人驾驶汽车发生交通事故，2016年5月7日美国特斯拉汽车自动驾驶汽车发生事故并造成驾驶员死亡，2017年3月24日优步无人驾驶汽车发生交通事故。这些案例将无人驾驶推上了风口浪尖，在无人驾驶时代，现行刑法的交通肇事罪的适用值得研究。

2.2 miR-409-3p 在鼻咽癌亲本细胞株及紫杉醇耐药细胞株之间的表达差异及miR-409-3p 与鼻咽癌紫杉醇耐药性之间的关系

采用实时荧光定量PCR 法检测miR-409-3p在鼻咽癌亲本细胞株CNE-1 和5-8F 及紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 之间的表达水平的差异。结果（图2A）显示，鼻咽癌紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p 的表达水平明显高于亲本细胞株CNE-1和5-8F，差异具有统计学意义（P值均＜0.001）。

为进一步明确miR-409-3p 可能参与鼻咽癌的紫杉醇耐药过程，在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中转染miR-409-3pinhibitor，并行实时荧光定量PCR验证。结果（图2B）显示，耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol中miR-409-3p-inhibitor组的miR-409-3p 的表达水平均明显低于NC-inhibitor组，差异具有统计学意义（P值均＜0.001）。

行CCK-8 实验检测抑制紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表达后，鼻咽癌细胞对紫杉醇耐药性的变化。结果（图2C）显示，NC-inhibitor组中紫杉醇对5-8F/Taxol 细胞的IC50值为（6.92±0.45）nmol/L，对CNE-1/Taxol 细胞的IC50值为（7.51±0.21）nmol/L；miR-409-3p-inhibitor组中紫杉醇 对5-8F/Taxol 细胞的IC50值为（1.85±0.33）nmol/L，对CNE-1/Taxol 细胞的IC50值为（2.52±0.31）nmol/L。

行集落形成实验再次检测抑制miR-409-3p表达后鼻咽癌细胞对紫杉醇耐药性的变化。结果（图2D）显示，NC-inhibitor组中紫杉醇对5-8F/Taxol 细胞的IC50值为（7.23±0.25）nmol/L，对CNE-1/Taxol 细胞的IC50值为（7.72±0.39）nmol/L；miR-409-3p-inhibitor组中紫杉醇 对5-8F/Taxol 细胞的IC50值为（1.30±0.37）nmol/L，对CNE-1/Taxol 细胞r 的IC50值为（2.20±0.45）nmol/L。

上述结果表明，抑制紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表达后鼻咽癌细胞对紫杉醇的耐药性明显降低。

Fig.1 The cell viability of nasopharyngeal carcinoma parental cells (5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells(5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) treated with different concentrations of taxol for 48 h was detected by CCK-8 assay(A) and colony formation assay (B) (n=3).图1 分别采用CCK-8 法（A）和集落形成实验（B）检测不同浓度紫杉醇对鼻咽癌亲本细胞CNE-1 和5-8F 以及紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 存活能力的影响

Fig.2 The expression level of microRNA (miR)-409-3p in nasopharyngeal carcinoma parental cells (5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (A).The expression level of miR-409-3p in CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with miR-409-3pinhibitor was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (B).The change in sensitivity to taxol was detected by CCK-8 assay (C) and colony formation assay (D).CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC)-inhibitor were taken as the controls.***P<0.001 (n=3).图2 实时荧光定量PCR 法检测miR-409-3p 在鼻咽癌亲本细胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表达水平（A）、转入miR-409-3p-inhibitor 对细胞中miR-409-3p 表达水平的影响（B）以及CCK-8 法（C）和集落形成实验（D）检测沉默miR-409-3p 表达对紫杉醇耐药细胞耐药性的影响

2.3 miR-409-3p 靶基因的预测与验证

前期研究提示，miR-409-3p 在鼻咽癌耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表达水平明显高于鼻咽癌亲本细胞CNE-1 和5-8F。通过Targetscan、miRDB、miRTarBase 和miRWalk数据库分别预测miR-409-3p 可能的下游靶基因，共预测得出10 个共同靶基因（ATXN3、ELF2、GAB1、GNAL、MTF2、NUFIP2、RDX、SEC62、ZEB1 和ZFHX4）（图3A）。鉴于此，通过实时荧光定量PCR 初步筛选miR-409-3p 的下游靶基因在鼻咽癌亲本与耐药细胞中的差异表达，发现MTF2 mRNA 在鼻咽癌耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中低表达，与miR-409-3p 的表达水平呈相反趋势。因此，本研究选择MTF2 作为miR-409-3p 的靶基因进行后续研究。用实时荧光定量PCR 检测耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中抑制miR-409-3p表达后对靶基因MTF2 表达水平的影响。结果（图3B）显示，miR-409-3p-inhibitor组中MTF2 mRNA 的表达水平明显上调（P值均＜0.01）。

采用蛋白质印迹法进一步检测耐药细胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中抑制miR-409-3p表达后MTF2 蛋白的表达水平。结果（图3C）显示，miR-409-3p-inhibitor组5-8F/Taxol 细胞中MTF2 蛋白的相对表达量为0.791±0.131，CNE-1/Taxol 细胞中为0.402±0.115；NCinhibitor组5-8F/Taxol 细胞中MTF2 蛋白的相对表达量为0.113±0.102，CNE-1/Taxol 细胞中为0.192±0.124；这一结果表明，与NC-inhibitor组相比，miR-409-3p-inhibitor组细胞中MTF2 蛋白质的表达水平均明显上调（P＜0.01 和P＜0.05）。

2.4 MTF2 与鼻咽癌紫杉醇耐药性之间的关系

Fig.3 Targetscan,miRDB,miRTarBase and miRWalk databases were used to analyze the target gene of microRNA(miR)-409-3p (A).The expression levels of MTF2 mRNA (B) and protein (C) in taxol-resistant nasopharyngeal carcinoma cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) transfected with miR-409-3p-inhibitor were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.Luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship between miR-409-3p and MTF2 gene (D).*P<0.05,**P<0.01 (n=3).图3 利用miRNA 靶基因预测网站预测miR-409-3p 的靶基因（A），采用实时荧光定量PCR 法（B）和蛋白质印迹法（C）检测沉默miR-409-3 表达后对耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中MTF2 mRNA及蛋白表达水平的影响，荧光素酶报告基因检测miR-409-3p 与MTF2 之间的靶向关系（D）

Fig.4 The expression levels of MTF2 mRNA (A) and protein (B) in nasopharyngeal carcinoma parental cells(5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.The expression level of MTF2 mRNA in 5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol cells transfected with pcDNA3.1-MTF2 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (C).The change in sensitivity to taxol in 5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol cells with MTF2 overexpression was detected by CCK-8 assay (D) and colony formation assay (E).CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC)(pcDNA3.1-NC) were taken as the controls.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.图4 分别采用实时荧光定量PCR 法（A）和蛋白质印迹法（B）检测MTF2 mRNA 及蛋白在鼻咽癌亲本细胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表达水平。实时荧光定量PCR 法检测转入重组载体pcDNA3.1-MTF2 对CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 细胞中MTF2 mRNA 表达水平的影响（C），CCK-8 法（D）和集落形成实验（E）检测MTF2 过表达后CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 细胞对紫杉醇敏感性的变化

分别采用实时荧光定量PCR 和蛋白印迹法检测MTF2 mRNA 和蛋白在鼻咽癌亲本细胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 中的表达差异。实时荧光定量PCR 检测结果（图4A）显示，MTF2 mRNA 在亲本细胞中的表达水平均明显高于紫杉醇耐药细胞（P＜值均0.01）。蛋白质印迹法检测结果（图4B）显示，MTF2 蛋白的相对表达量，在亲本CNE-1 细胞中为0.91±0.11，耐药CNE-1/Taxol 细胞中为0.41±0.21，亲本5-8F 细胞中为0.59±0.24，耐药5-8F/Taxol 细胞中为0.2±0.12；MTF2 蛋白在亲本细胞中的表达水平均明显高于紫杉醇耐药细胞（P值均＜0.05）。上述结果表明，MTF2 可能参与了鼻咽癌对紫杉醇的耐药。

将pcDNA3.1-MTF2 和阴性对照pcDNA3.1-NC 分别转入耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中，行实时荧光定量PCR法检测对耐药细胞中的MTF2 mRNA 表达水平的影响。结果（图4C）显示，pcDNA3.1-MTF2组耐药细胞中MTF2 mRNA 的表达水平均较对照组明显上调（P值均＜0.001）。进一步行CCK-8 法检测耐药细胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 中过表达MTF2 后细胞对紫杉醇药物敏感性的变化，结果（图4D）显示，对照组（pcDNA3.1-NC组）中紫杉醇对5-8F/Taxol 细胞的IC50值为（6.75±0.42）nmol/L，对CNE-1/Taxol 细胞的IC50值为（8.82±0.23）nmol/L；pcDNA3.1-MTF2组中紫杉醇对5-8F/Taxol 细胞的IC50值为（1.84±0.29）nmol/L，对CNE-1/Taxol 细胞的IC50值为（1.53±0.47）nmol/L。相应的集落形成实验结果（图4E）显示，对照组（pcDNA3.1-NC组）中紫杉醇对5-8F/Taxol 细胞的IC50值为（6.93±0.52）nmol/L，对CNE-1/Taxol 细胞的IC50值为（7.93±0.51）nmol/L；pcDNA3.1-MTF2组中紫杉醇对5-8F/Taxol 细胞的IC50值为（1.92±0.48）nmol/L，对CNE-1/Taxol 细胞的IC50值为（1.21±0.44）nmol/L。与阴性对照组细胞相比，耐药细胞中过表达MTF2 后，紫杉醇5-8F/Taxol 和CNE-1/Taxol细胞的IC50值均明显降低，差异具有统计学意义（P值均＜0.05）。

上述结果提示，MTF2 参与了鼻咽癌细胞对紫杉醇的耐药，鼻咽癌紫杉醇耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中上调MTF2 的表达水平后其紫杉醇的耐药性被降低。

2.5 MTF2 与细胞凋亡之间的关系

用紫杉醇（2 nmol/L）分别处理转入重组载体pcDNA3.1-MTF2组和阴性对照pcDNA3.1-NC 的5-8F/Taxol细胞，48 h 后采用FCM 检测细胞的凋亡情况。结果（图5）显示，细胞的凋亡率由MTF2 阴性对照组的3.05% 提高到MTF2 过表达组的8.47%，2组差异有统计学意义（P＜0.05）。这一结果结果表明，过表达MTF2 可以促进紫杉醇诱导的鼻咽癌细胞的凋亡，从而促进了鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感性。

Fig.5 The apoptosis rate of taxol-resistant 5-8F/Taxol cells transfected with pcDNA3.1-MTF2 was detected by FCM.5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC) (pcDNA3.1-NC) were taken as the control.图5 FCM 检测紫杉醇对MTF2 过表达的紫杉醇耐药细胞5-8F/Taxol 凋亡率的影响

3 讨论

鼻咽癌治疗中出现紫杉醇耐药是一个长期存在的临床问题，而获得性耐药的发生是患者化疗疗效欠佳的重要原因[11-12]。有报道提示，miRNAs 能改变肿瘤细胞对化学治疗的敏感性，miRNA 上调或者miRNA 沉默都可能增加化疗的效果[13]，考虑到紫杉醇在鼻咽癌治疗方面的广泛应用，寻找紫杉醇耐药的治疗靶点对提高临床疗效具有重要意义，因此本文重点探讨了miR-409-3p 在鼻咽癌紫杉醇耐药中的作用。

既往研究表明，miR-409-3p 可调控肿瘤细胞的增殖、细胞凋亡以及细胞的迁移和侵袭等[14-18]。BAI 等[19]研究发现，miR-409-3p 在结肠癌癌组织中的表达较正常组织低，其靶基因GRB2 相关结合蛋白可介导多条信号转导途径，与生长因子、细胞因子和抗原受体等多种受体结合，调节细胞生长分化，从而抑制结肠癌细胞的转移与侵袭。然而关于miR-409-3p 在鼻咽癌中的发挥的作用目前尚不清楚，本课题组以鼻咽癌亲本细胞CNE-1 和5-8F 以及耐药细胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 为研究对象，验证耐药细胞有足够的耐药性，发现耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p 的表达水平明显高于亲本细胞CNE-1 和5-8F；随后通过抑制耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表达水平后发现，细胞对紫杉醇的耐药性降低，表明miR-409-3p 在鼻咽癌的耐药过程中可能发挥一定的作用。但是miR-409-3p 影响鼻咽癌紫杉醇耐药性的机制尚不清楚。

为了进一步研究miR-409-3p 的潜在靶点和其分子作用机制，本研究中通过在线数据库预测和双荧光素酶报告基因实验证实了MTF2 是miR-409-3p 的直接功能靶点。SEKYERE 等[20]的研究表明，MTF2 在各种疾病患者的血清中存在，但是其生物学功能仍有待研究。MAGANTI等[21]研究发现，MTF2 可调节白血病化疗的耐药性。本研究中发现，MTF2 在鼻咽癌亲本细胞CNE-1 和5-8F 中的表达水平明显高于耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol；过表达耐药细胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中MTF2 的表达水平后发现，细胞耐药性降低。本研究中发现，MTF2 与miR-409-3p 在mRNA 及蛋白的表达水平均呈负相关性，说明在鼻咽癌细胞中miR-409-3p 可能抑制MTF2 的表达，MTF2 是miR-409-3p 的潜在靶基因。

化疗药物促进肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤治疗的重要机制之一[22]。肿瘤细胞耐药的主要机制与跨膜蛋白的过表达密切相关，这些蛋白质可以直接降低细胞内化疗药物的浓度[23]。放化疗主要是通过调节相关跨膜蛋白表达，促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用[24]。此外，MAGANTI 等[21]研究发现，MTF2 可调节p53 信号通路改变细胞生长周期和凋亡水平而改变化疗的敏感性，使白血病对诱导化疗药物敏感。为进一步探索鼻咽癌紫杉醇耐药与细胞凋亡之间的关系，本研究中构建了MTF2 过表达的耐药细胞5-8F/Taxol，结果显示过表达MTF2 后5-8F/Taxol 细胞凋亡率较对照组明显提高，表明上调MTF2 表达可促进鼻咽癌紫杉醇耐药细胞的凋亡。

综上所述，本研究发现miR-409-3p 靶向负调控MTF2 的表达，抑制此信号轴可以促进紫杉醇诱导的细胞凋亡，可作为逆转鼻咽癌化疗耐药的靶分子，为鼻咽癌患者建立新的治疗策略提供了前期理论基础。