AAV患儿的高背景cANCA阳性荧光模式和实验室特征①

代玉梅 朱品谋 林茗嫣 刘云锋（广州医科大学附属妇女儿童医疗中心临床检验部，广州510623）

抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎［（antineutrophil cytoplasmic autoanti-body，ANCA）-associated vasculitis，AAV］是一类以原发或继发性小、中血管结构反应性损伤伴血管壁白细胞浸润为特征的系统性自身免疫性疾病［1］。ANCA在其发病、诊断及临床分类中具有重要价值［2］。虽然AAV在儿童中发病率较低，若累及肾脏等器官可能会造成严重后果［3］。目前临床试验室用于AAV筛查的常规项目是血管炎4项：间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）判断ANCA类型为核周型（perinuclear pattern，pANCA）、胞浆型（cytoplasmic pattern，cANCA）或非典型（atypical pattern，aANCA）；ELISA鉴定靶抗原髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和/或蛋白酶3（proteinase 3，PR3）。用于ANCA IIF分析的基质片有单基质、双基质、多基质等。本研究采用欧蒙公司生产的、经甲醛和乙醇固定的正常中性粒细胞构成的双基质片。

课题组发现，某些患儿的血清标本在排除黄疸等干扰因素影响且标准化操作下，仍会在基质片上呈现较强的绿色荧光背景，产生原因不明。本研究以2016年1月至3月初诊并行血管炎4项筛查的AAV患儿为对象，比较分析ANCA阳性高背景组、ANCA阳性无背景组与血管炎4项检测均阴性组患儿血清主要的免疫学指标（IgG、IgE，补体C3、C4）、肝脏生化指标［白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）］和血液学指标［白细胞计数（WBC）、淋巴细胞计数（LYMP）、中性粒细胞计数（NEUT）、血小板计数（PLT）、血小板宽度（PDW）等］，观察高背景cANCA阳性AAV患儿的实验室特征，并探讨非特异性绿色荧光背景产生的可能原因。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选取2016年1月至3月初我院收治的初诊、行血管炎4项检测的AAV患儿，分组收集ANCA阳性高背景、ANCA阳性无背景、血管炎4项均呈阴性的血清标本共90例（30例/组，剔除溶血、脂血、黄疸标本），同时收集患儿外周EDTA抗凝血标本进行相关血液学指标分析。

1.1.2 主要试剂与仪器ANCA IIF检测试剂盒、anti-MPOELISA检测试剂盒、anti-PR3 ELISA检测试剂盒（德国欧蒙）；IgG、IgE、C3、C4诊断试剂盒（美国贝克曼库尔特）；ALB、ALT、AST生化分析试剂盒（北京九强）；BX517R-32FB3-F01免疫荧光显微镜（日本奥林巴斯）；IMMAGE 800特种蛋白分析仪（美国贝克曼库尔特）；全自动生化分析仪（7600，日本日立）；System XE-5000全自动血液分析仪（美国希森美康）。

1.2 方法

1.2.1 血管炎4项检测 待检血清（起始稀释度为1∶10）采用ANCA IIF双基质检测试剂盒进行IIF染色，荧光显微镜下由2名资深技术专家判断ANCA的荧光模式：乙醇基质中显示分布在整个中性粒细胞胞浆中的颗粒型荧光为胞浆型（cANCA），中性粒细胞核周显示光滑带状荧光为核周型（pANCA），注意排除抗核抗体（ANA）干扰。荧光高背景：常规IIF染色，固定中性粒细胞的背景基质呈可见的较强绿色荧光；荧光无背景：常规IIF染色，固定中性粒细胞的背景基质无明显可见绿色荧光。采用anti-MPO/PR3 ELISA试剂盒半定量分析待检血清中的靶抗原。

1.2.2 免疫球蛋白及补体检测 血清IgG、IgE、C3、C4按照商品化试剂盒操作说明书采用IMMAGE 800全自动酶免仪分析。

1.2.3 肝脏生化指标及血液学指标检测 采用ALB、ALT、AST试剂盒及7600全自动生化分析仪定量分析待测血清中相应生化指标，血液分析仪System XE5000常规分析患儿外周血WBC、LYMP、NEUT、PLT和PDW，严格按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析 采用Chi-square进行二分类资料检验；计量资料多组间比较采用Ordinary Oneway ANOVA检验；组间两两比较采用Turkey's multiple comparison test。P＜0.05为 差 异 具 有 统 计 学意义。

2 结果

2.1 受试人群一般临床特征ANCA阳性高背景组患儿74%为男性（20/27），平均年龄略高于ANCA阳性无背景组。ANCA阳性高背景组与ANCA阳性无背景组患儿血清cANCA、pANCA、MPO阳性率存在显著差异（P＜0.01，表1）。IIF染色后，双基质片中，27例ANCA阳性高背景组患儿血清在乙醇侧（EOH）主要表现为具有较强绿色荧光背景的弱阳性cANCA核型（44.44%，仅1例pANCA），甲醛侧（HCHO）荧光染色均为阴性（或弱阳性）；25.93%（7/27）患儿靶抗原为MPO，14.82%（4/27）患儿靶抗原为PR3。ANCA阳性无背景组患儿血清在双基质片中则仅在已固定的中性粒细胞核周或胞浆出现典型绿色荧光，核型主要为阳性或弱阳性pANCA（64.29%，18/28），背景干净清晰、无绿色荧光；39.29%（11/28）患儿靶抗原为MPO，10.71%（3/28）患儿靶抗原为PR3。ANCA阳性高背景及无背景患儿血清多伴有低滴度ANA（图1）。

表1 ANCA阳性高背景组、阳性无背景组及阴性人群血管炎4项分析［±s，例（%）］Tab.1 Analysis of 4-items vasculitis in positive high background group，positive no background group and negative population［±s，n（%）］

表1 ANCA阳性高背景组、阳性无背景组及阴性人群血管炎4项分析［±s，例（%）］Tab.1 Analysis of 4-items vasculitis in positive high background group，positive no background group and negative population［±s，n（%）］

Features Male/Female Age（month）cANCA（+）pANCA（+）MPO（+）PR3（+）ANCA+With background（n=27）20/7 65.3±10.02 12（44.44）1（3.70）7（25.93）4（14.82）Without background（n=28）12/16 34.71±8.19 6（21.43）18（64.29）11（39.29）3（10.71）ANCA-（n=30）12/18 67.71±9.68 0 0 0 0 P＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

图1 IIF高背景ANCA在乙醇/甲醛基质中的代表性结果Fig.1 Representative results of IIF high background ANCA in EOH/HCHO fixed matrix

2.2 ANCA阳性高背景组患儿免疫学指标3组受试患儿血清IgG、IgE、C3、C4分析结果如图2所示，ANCA阳性高背景组血清IgG水平［（9.87±4.34）μg/ml］显著低于ANCA阳性无背景组［（13.89±6.43）μg/ml，P＜0.05］及阴性对照组［（10.39±4.75）μg/ml，P＞0.05］；ANCA阳性高背景组血清C3［（1.22±0.39）μg/ml］显著高于ANCA阳性无背景组［（0.88±0.33）μg/ml，P＜0.05］和阴性对照组［（0.96±0.26）μg/ml，P＜0.01］；IgE、C4虽在ANCA阳性高背景组、ANCA阳性无背景组及阴性对照组呈逐渐增高或降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 ANCA阳性高背景组、ANCA阳性无背景组及阴性对照组免疫学指标比较Fig.2 Comparison of immunological index in ANCA positive high background group，ANCA positive no background group and negative control group

2.3 ANCA阳性高背景组患儿肝脏生化指标3组患儿肝脏生化指标检测结果显示，ANCA阳性高背景组ALB、ALT、AST水平均高于ANCA阳性无背景组及阴性对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。

图3 ANCA高背景组、ANCA无背景组及阴性对照组肝脏生化指标比较Fig.3 Comparison of liver biochemical indexes in ANCA high background group，ANCA no background group and negative control group

2.4 ANCA阳性高背景患儿血液学指标3组患儿血液学检测指标分析结果显示，ANCA阳性高背景组WBC、LYMP及PDW水平均高于ANCA阳性无背景组和阴性对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。ANCA阳性高背景组患儿PLT计数［（402.6±191.2）×1012个/L］显著高于ANCA阳性无背景组［（302.3±22.9）×1012个/L，P＜0.05］；ANCA阳性高背景组RBC计数［（4.39±0.39）×1012个/L］与ANCA阳性无背景组患儿［（3.99±0.94）×1012个/L］低于阴性对照组［（4.49±0.40）×1012个/L］，且ANCA阳性无背景组与阴性对照组差异显著（P＜0.05）。

图4 ANCA阳性高背景组、ANCA阳性无背景组及阴性对照组血液学指标比较Fig.4 Comparison of hematological indexes in ANCA positive high background group，ANCA positive no background group and negative control group

3 讨论

中性粒细胞活化及补体系统参与是AAV病程中的主要事件。临床常根据ANCA在IIF染色时呈现的荧光模式和对应的靶抗原进行AAV诊断并判断药物疗效。已知的ANCA靶抗原除MPO、PR3外，尚有杀菌/通透性增加蛋白酶、组织蛋白酶G、乳铁蛋白等［4］，目前临床试验室筛查较为普遍的是MPO和PR3。

课题组ANCA实际检测发现，某些患儿的临床血清标本在IIF染色时会出现较强的绿色荧光背景，而成人血清标本则鲜少出现此种情况。为探索这种非特异性荧光高背景产生的可能原因，课题组随机留取行AAV筛查的ANCA阳性高背景、ANCA阳性无背景及血管炎4项均呈阴性的患儿血清标本，观察ANCA阳性高背景血清标本的荧光类型及非特异性高背景的形成规律，并比较3组患儿的主要实验室指标，寻找可能与绿色荧光背景相关的因素。

IIF分析结果显示，高背景ANCA阳性病例性别构成多为男性，血清在双基质片中呈现的皆为甲醛敏感型cANCA，靶抗原MPO、PR3阳性率分别为25.93%、14.82%，提示这些ANCA阳性高背景血清存在MPO、PR3以外的未知粒细胞（或单核细胞）自身抗原。ANCA阳性无背景组pANCA阳性率较ANCA阳性高背景组明显升高，且多为pANCA和cANCA双阳的混合模式，MPO检出率相对较高（39.29%），提示pANCA相关儿童血管炎靶抗原与成人相似，多为MPO，这些初诊的ANCA阳性无背景AAV患儿与高背景组患儿相比，年龄相对偏小，这种非典型的双阳模式产生原因有待进一步研究。

循环型IgG在乙醇固定的中性粒细胞基质片上可呈现胞浆型荧光［5］。IgG的某些亚类水平与疾病鉴别诊断有关［6］。3组患儿血清免疫学指标检测结果显示，ANCA阳性高背景组总IgG水平低于ANCA阳性无背景组和阴性对照组，且与ANCA阳性无背景组存在显著差异，提示疾病状态下ANCA阳性无背景组患儿产生更高滴度的自身抗体。研究发现，治疗AAV的药物环磷酰胺、硫唑嘌呤、利妥昔单抗等可能会诱导低IgG血症和B细胞数减少［7-8］。这些小分子药物半抗原可能会与患儿血清中的某些蛋白（或IgG）结合成完全抗原，刺激机体产生相应IgG，并与基质片上的抗原发生非特异性结合产生绿色高荧光背景。对初诊患者而言，药物对实验结果的影响是不存在的，本研究发现，某些血管炎4项全阴性患儿抽血前及时静注人IgG、阿司匹林或人源化单抗，IIF染色时也并未出现非特异性绿色荧光背景，提示药物应用并非导致非特异性荧光背景的必然原因。若要排除药物对于ANCA筛查时绿色背景的影响，需要更严格地挑选实验对象、更精密的实验设计以排除混杂因素（如血药浓度、血药半衰期、药物代谢和药物动力学等）的影响，以防得出有歧义的结论。

C3是体内最丰富的补体蛋白，3条补体激活途径的启动均需C3参与。C3是非常重要的炎症介质，在调理吞噬、介导炎症、趋化白细胞、调节免疫应答、溶解免疫复合物、针对自身小分子抗原的特异性抗体形成等免疫进程中发挥重要作用。近年研究表明，补体活化在AAV病程中扮演重要角色［9］。MPO阳性的活动期AAV患者外周EDTA抗凝血浆补体降解物C3a、C5a、sC5b-9水平较正常人群较高，缓解期Bb、C3a、sC5b-9水平更高，而PR3阳性的活动期AAV患者C3a、C5a、sC5b-9和C4d水平较高，缓解期时C3a、C4d水平更高，血清C3较低的AAV患者生存率较低，肾功能预后相对较差［10］。本研究发现，ANCA阳性高背景组C3水平显著高于ANCA阳性无背景组及阴性对照组，说明ANCA阳性高背景组患儿血清补体呈高活化状态，非特异性绿色强荧光背景的产生可能与患儿血清C3水平有关。结合ANCA阳性高背景组及阳性无背景组患儿外周血RBC计数均低于阴性对照组，课题组认为C3及RBC的组间差异可能与患儿机体炎症状态及血液免疫复合物的清除有关；C3水平相对较高的ANCA阳性高背景组患儿预后可能相对较好。

AAV患者血液中的免疫细胞亚群尤其是调节淋巴细胞亚群的数目和功能与自身免疫应答的启动、蔓延及自身抗体的产生有关［11］。PLT升高作为活动性AAV诊断的生物标志物，对区分活动期AAV和缓解期AAV、活动性疾病与急性感染有重要意义［12］。PLT/淋巴细胞比值（PLR）是临床上评价患者疾病负荷的有效指数，与AAV诊断密切相关［13］。课题组发现，除RBC存在组间差异外，ANCA阳性高背景组患儿WBC、LYMP、PDW指标均高于ANCA阳性无背景组及阴性对照组，PLT计数也明显高于ANCA阳性无背景组，除受患儿机体炎症状态和疾病活动度影响外，这种显著差异可能也与研究对象的疾病构成有关。ANCA阳性高背景组有12例川崎病，阳性无背景组有5例过敏性紫癜。前者是一种以全身血管炎为主要病变的急性发热出疹性小儿疾病，高发于5岁以下婴幼儿（男多于女），患儿临床特征多伴有WBC及PLT升高，过敏性紫癜患儿则多伴有PLT降低，异常增高的PLT是否是免疫荧光高背景形成的直接驱动因素有待深入研究。

综上，伴有非特异性高荧光背景产生的ANCA多为甲醛敏感型cANCA，患者体内同时有较低滴度的ANA。本研究显示，AAV患儿的炎症状态激活中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞及补体系统，细胞损伤及损伤细胞胞内成分释放作为新的抗原成分刺激宿主产生cANCA、ANA等抗体。非特异性绿色荧光背景的形成可能是PR3以外的新抗原在基质片上呈现的一种非典型的、新的荧光模式。患儿血液学指标以低IgG、高C3、高PLT为特征，未来课题组将进一步验证IgG（及亚类）、C3、PLT与ANCA间接荧光高背景的关系（排除C3、补给IgG等），并探索相关机制。