实验性自身免疫性脑脊髓炎与肠道免疫微环境相关性的Meta分析

刘晓君 彭小燕 马金昀 程晓东

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院临床免疫研究所，上海200437）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是中枢神经系统以炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病，临床表现以肢体瘫痪、感觉异常、共济失调、视力障碍、精神异常等反复发作的神经功能障碍为主，具有高复发率、高致残率和难治愈等特点［1-2］。MS的确切病因目前尚未完全阐明，遗传因素和环境因素（如EB病毒感染、低维生素D状态、吸烟、肠道微生态系统）都共同参与MS的发生发展［3］。MS及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）常伴随肠道微生物群结构的变化，肠黏膜屏障完整性的破坏和肠道免疫系统的激活，继而通过菌-肠-脑轴上行途径触发中枢神经系统的炎症和神经变性。MS患者的肠道免疫微环境与健康人群相比存在明显差异，如MS患者肠道通透性增加、炎性Th17细胞数目增多等，其均与肠道微生物群的特异性改变密切相关［4-5］。研究发现，无菌（germ free，GF）小鼠经菌群移植接受来自MS患者的肠道菌群后诱导EAE，与接受来自健康人群肠道菌群的GF小鼠相比，其神经症状明显加重［6-7］。此外，在无菌小鼠与无特定病原体（specific pathogen free，SPF）小鼠的EAE动物模型中，无菌EAE小鼠发病时间延后，神经症状评分降低，并伴随肠道和脊髓中IFN-γ和IL-17等炎症细胞因子分泌的减少，抑制炎性的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例显著升高［8］。

较多研究表明肠道菌群的失调、肠道免疫功能的紊乱与中枢神经系统疾病的发生发展密切相关［9-11］，而动物实验是临床前基础研究的关键步骤，经过严格评估的动物实验结论可作为开展临床研究的证据支持。因此本研究旨在通过Meta分析对MS动物模型EAE与肠道免疫微环境变化的关系进行系统性分析，以期更深入地认识MS的发病机理，为后续临床研究的开展提供可靠的循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 检索策略 以“实验性自身免疫性脑脊髓炎”“肠道菌群”“肠道微生物群”“肠道免疫”“肠道黏膜免疫”“肠道T淋巴细胞”“肠道B淋巴细胞”“肠道巨噬细胞”“肠道树突状细胞”等为中文检索词，检索CNKI的中国学术期刊全文出版总库、维普中文科技期刊数据库、万方中国学术期刊数据库等中文数据库。以“Experimental autoimmune encephalomyelitis”“EAE”“Microbiota”“Microbiome”“Gut or Intestinal immunity”“Gut or Intestinal mucosal immunity”“Gut or Intestinal T cell”“Gut or Intestinal B cell”“Gut or Intestinal Macrophage”“Gut or Intestinal Dendritic cell”等为英文检索词，检索Pubmed、Science Direct和Medline英文数据库。检索时间为建库至2020年1月8日，检索语言无限制。

1.2 文献纳入标准 ①研究设计类型为对照研究，不限制其是否实施随机分组；②研究对象为EAE啮齿类动物疾病模型，对动物种属和来源不进行限制，对具体造模方法亦不限制；③结局指标为EAE模型肠道菌群丰度及肠道内淋巴细胞百分比；④原始文献为公开发表文献。

1.3 文献排除标准 ①重复报道或针对同一研究对象的多个文献（纳入样本量最大、质量最好的）；②数据不完整，无法提取原始数据统计的文献；③无法获取原文的文献；④会议论文、学位论文；⑤综述文献。

1.4 文献资料提取2名研究者对最初搜索所得文章的标题进行相关性审查，并使用研究纳入/排除标准对文章摘要进行评估，对初筛后所得文章进行全文阅读，以进一步审查是否符合纳入标准。2名研究者对纳入的文献独立地进行数据提取和质量评价，并交叉核对，如遇分歧则由第三方裁决。文献提取内容包括：第一作者/发表时间、动物种属、动物周龄、动物性别、研究例数、随机方法、结局指标等。

1.5 文献偏倚风险评估2名研究者根据SYRCLE中心定制的SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具（SYRCLE's Risk Of Bias Tool For Animal Studies），对纳入的文献进行偏倚风险评估［12-13］。该工具是专门适用于动物实验内在真实性评估的工具，包括6种偏倚类型的10个条目：①选择性偏倚（序列产生、基线特征、分配隐藏）；②实施偏倚（动物安置随机化、盲法）；③测量偏倚（随机性结果评估、盲法）；④失访偏倚（不完整数据报告）；⑤报告偏倚（选择性结果报告）；⑥其他偏倚。评估结果以“是”“否”和“不确定”分别代表“低偏倚风险”“高偏倚风险”和“不确定偏倚风险”。2名研究者分别独立进行偏倚风险评分，并进行交叉验证，当意见不一致时，经讨论后寻求第三方建议。

1.6 统计学分析 采用Cochrane协作网推荐的Review Manager 5.3软件进行Meta分析。对于连续性资料，肠道内淋巴细胞百分比及肠道菌群丰度采用均数差（mean difference，MD）及95%CI为疗效分析统计量，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用I2值衡量各研究间异质性大小，I2≥50%采用随机效应模型，并分析其异质性来源，I2＜50%采用固定效应模型［14］。对无法进行数据合并的结局指标，采用描述性方法进行分析。原始数据通过GetData Graph软件获取，连续性数据参照刘海宁等［15］的方法进行提取。

2 结果

2.1 检索结果 通过关键词检索，本研究共检索到1 176篇文献与“肠道免疫”“肠道菌群”和“实验性自身免疫性脑脊髓炎”相关的文章，其中Pubmed 588篇，Science Direct 172篇，Medline 416篇。经过EndNote软件查重后，排除重复文献898篇，对剩余247篇文献进行标题和摘要阅读，排除非病例对照研究、非动物实验、与主题明显不相符的文献166篇，剩81篇文献进行全文阅读，排除与主题无关、无数据或数据不相关、无法获取原文等文献，最终纳入8篇，全部为英文文献，其中，与肠道免疫相关3篇，与肠道菌群相关5篇，具体文献检索流程见图1。

图1 文献检索流程及结果Fig.1 Flow chart of literature search and study selection process

2.2 文献纳入情况 本研究共纳入发表年份在2013年至2019年间的8篇文献，共纳入123例研究对象，其中样本量最少3例，最多24例。5项研究观察了模型组与对照组肠道菌群相对丰度的差异，3项研究观察了模型组与对照组肠道Th17、Treg的百分比。纳入文献的基本特征见表1。

表1 纳入文献的基本特征Tab.1 Details of included studies

2.3 偏倚风险评估 偏倚风险评估的具体结果见表2。纳入的8个对照实验中，仅有2个实验研究采用随机数字表法进行了随机分组，其他研究均未详细描述说明。

表2 纳入研究的SYRCLE偏倚风险评估结果Tab.2 SYRCLE bias risk assessment results of inclusion researches

2.4 Meta分析结果

2.4.1 模型组与正常组乳酸杆菌属 共3篇文献研究了乳酸杆菌属的变化［16-18］。Meta分析结果显示Note：Animal：B.BALB/C mice，C.C57BL/6 mice，N.NOD mice，H.HLA-DR3.DQ8 transgenic mice；Gender：F.Female；NA.Not available；C.Control，M.Model；Outcome assessment：（1）.Th17，（2）.Treg，（3）.Lactobacillus，（4）.Bacteriodetes，（5）.Verrucomicrobia，（6）.Alistipes，（7）.Tenericutes，（8）.Firmicutes.各研究之间存在较高的异质性（I2=73%，P＜0.05），故采用随机效应模型进行数据合并分析，Meta分析结果显示：MD=-3.26，95%CI：-5.06，-1.47，P=0.000 4，差异有统计学意义，表明EAE模型组肠道内有益菌乳酸杆菌显著减少。见图2、表3。

图2 Lactobacillus相对丰度比较的Meta分析Fig.2 Meta analysis of Lactobacillus relative abundance comparison

2.4.2 模型组与正常组拟杆菌门 共2篇文献研究了拟杆菌门的变化［19-20］。Meta分析结果显示各研究之间未见明显的异质性（I2=0%，P＞0.01），故采用固定效应模型进行数据合并分析，Meta分析结果显示：MD=-4.44，95%CI：-7.31，-1.57，P=0.002，差异有统计学意义，表明EAE模型组肠道拟杆菌门显著减少。见图3、表3。

图3 Bacteriodetes相对丰度比较的Meta分析Fig.3 Meta analysis of Bacteriodetes relative abundance comparison

2.4.3 模型组与正常组疣微菌 共2篇文献研究了疣微菌的变化［19-20］。Meta分析结果显示各研究之间存在很高的异质性（I2=93%，P＜0.01），故采用随机效应模型进行数据合并分析，Meta分析结果显示：MD=11.72，95%CI：5.95，17.49，P＜0.000 1，差异有统计学意义，表明EAE模型组肠道内疣微菌显著高于正常对照组。见图4、表3。

图4 Verrucomicrobia相对丰度比较的Meta分析Fig.4 Meta analysis of Verrucomicrobia relative abundance comparison

2.4.4 模型组与正常组Alistipes菌属 共2篇文献研究了Alistipes菌属的变化［17-18］。Meta分析结果显示各研究之间存在很高的异质性（I2=97%，P＜0.01），故采用随机效应模型进行数据合并分析，Meta分析结果显示：MD=-1.52，95%CI：-6.35，3.31，P=0.54，差异无统计学意义，表明Alistipes菌属变化与EAE之间无显著相关性。见图5、表3。

图5 Alistipes相对丰度比较的Meta分析Fig.5 Meta analysis of Alistipes relative abundance comparison

2.4.5 模型组与正常组柔膜菌门 共2篇文献研究了柔膜菌门的变化［19-20］。Meta分析结果显示各研究之间存在很高的异质性（I2=98%，P＜0.01）。采用随机效应模型进行数据合并分析，I2=98%，Meta分析结果显示：MD=-0.67，95%CI：-2.63，1.29，P=0.50，差异无统计学意义，表明柔膜菌门变化与EAE之间无显著相关性。见图6、表3。

图6 Tenericutes相对丰度比较的Meta分析Fig.6 Meta analysis of Tenericutes relative abundance comparison

表3 肠道菌群相对丰度比较的Meta分析Tab.3 Meta-analysis of relative abundance of intestinal microbiota

2.4.6 模型组与正常组厚壁菌门 共2篇文献研究了厚壁菌门的变化［19-20］。Meta分析结果显示各研究之间存在很高的异质性（I2=80%，P＜0.05）。采用随机效应模型进行数据合并分析，I2=80%，Meta分析结果显示：MD=-1.67，95%CI：-9.22，5.88，P=0.66，差异无统计学意义，表明厚壁菌门变化与EAE之间无显著相关性。见图7、表3。

图7 Firmicutes相对丰度比较的Meta分析Fig.7 Meta analysis of Firmicutes relative abundance comparison

2.4.7 模型组与正常组肠道Th17细胞 纳入的3篇文献报道了模型组与正常组肠道内Th17细胞的百分比。Meta分析结果显示各研究之间存在很高的异质性（I2=100%，P＜0.01），因此这一数据不进行合并分析，采用描述性分析。DUC等［17］2019年的研究中模型组RORγT+IL-17+T细胞百分比为（18.73±5.85）%，正常组百分比为（11.85±2.63）%，差异有统计学意义，P＜0.05。NOURI等［21］2014年的研究中模型组CD3+IL-17+T细胞百分比为（30.53±2.26）%，正常组百分比为（5.09±0.85）%，差异有统计学意义，P＜0.001。SUZANA等［22］2017年的研究中模型组Th17细胞百分比为（1.75±0.53）%，正常组百分比为（0.26±0.18）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4.8 模型组与正常组肠道Treg纳入的3篇文献报道了模型组与正常组肠道内Treg细胞的百分比［17，21-22］。Meta分析结果显示各研究之间存在很高的异质性（I2=95%，P＜0.01），采用随机效应模型进行数据合并分析，Meta分析结果显示：MD=-1.74，95%CI：-2.85，-0.63，P=0.002，差异有统计学意义。见图8。

图8 肠道内Treg比较的Meta分析Fig.8 Meta analysis of Treg in the intestine

3 讨论

本研究系统性地评价了已发表数据关于MS动物模型EAE肠道菌群，肠道内Th17、Treg淋巴细胞变化的结局指标。共3篇文献研究了乳酸杆菌属的变化［16-18］，由于存在较高异质性，对纳入研究进行敏感性分析，在排除MANGALAM等［16］2017的研究后异质性显著下降（I2=0%，P＞0.05），或排除LI等［18］的研究后异质性显著下降（I2=0%，P＞0.05）；对异质性较大的文献进行分析，MANGALAM等［16］2017研究所用的对象为转基因小鼠，而其余两组为C57BL/6小鼠，实验对象的差异可能造成了较大的异质性；LI等［18］的研究中，相比其余两项研究，研究对象样本量较大，实验对象数量的差异可能造成了较大的异质性。共2篇文献研究了疣微菌的变化［19-20］，对纳入的2篇文献进行异质性分析，两项研究中研究对象背景、饲养环境、周龄、样本量、造模方式等均相当，二者观察时间点不同可能是异质性较大的来源。共2篇文献研究了Alistipes菌属的变化［17-18］，因存在较高的异质性，对两篇文献进行异质性分析，发现两项研究中研究对象种类及样本量存在的显著差异可能是异质性较高的主要来源。纳入的3篇文献［17，21-22］报道了模型组与正常组肠道内Treg的百分比，因研究存在很高的异质性，采用敏感性分析，剔除NOURI等［21］2014的研究后异质性显著降低（I2=34%）。对异质性较大的文献进行分析，发现该研究中动物模型为过继转移型EAE，研究对象模型存在的差异可能是异质性较高的主要来源。本研究结果显示，EAE鼠肠道内存在菌群结构的改变，乳酸杆菌和拟杆菌含量显著减少，而疣微菌门含量增加，Alistipes菌、厚壁菌、柔膜菌门含量未见显著变化。模型组肠道内Th17细胞高于正常组，模型组肠道内Treg细胞低于正常组，差异有统计学意义。

研究表明，MS患者肠道微生物群、肠道免疫细胞与健康人相比存在明显差异。MS患者肠道中甲氧短杆菌、嗜黏蛋白-艾克曼菌、不动杆菌等菌群显著富集，而隶属拟杆菌门的丁酸弧菌等数量明显减少［6-7，23］，口服益生菌（乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属）可缓解MS患者症状，促进有益菌乳杆菌属含量的增加［24］。在MS动物模型研究中，肠道菌群被认为是发生脱髓鞘的初始介导因子［25］。Albino oxford（AO）大鼠对EAE的诱导具有极强的抵抗力，抗生素对AO大鼠肠道微生物群的扰动改变了肠道微生物群的组成，伴随Peyer氏结、肠系膜淋巴结中调节性T细胞比例减少，导致AO大鼠表现出EAE症状，CNS中观察到更多的炎性浸润和更高的IL-17产生，而将AO肠道菌群移植到易患EAE的豚鼠身上改善了疾病的严重程度［26］。表明肠道菌群、肠道免疫的变化与MS/EAE的发生发展密切相关。

MS目前被广泛认为是由遗传因素和环境因素相互作用共同导致的自身免疫性疾病。辅助性T细胞（T helper cell，Th）17型是MS关键的致病细胞，是第一批透过血脑屏障浸润CNS的外周淋巴细胞［27］。尽管Th17被认为是MS的核心致病细胞，但其在外周激活的部位仍不明确。研究表明，肠道微环境是允许自身反应性T细胞迁移到大脑的主要部位，是控制CNS髓鞘特异性T细胞的重要部位之一［28］。EAE是研究MS的经典动物模型，因此，确定MS动物模型EAE小鼠肠道内淋巴细胞情况对探索MS的病因和病理机制具有重要意义。在EAE小鼠模型中，髓鞘特异性T细胞的激活及分化为致病性的Th17细胞主要发生在肠道内［29-30］。在主动免疫和过继免疫的两种EAE模型中，研究者观察到在中枢神经症状发生之前，脑源性Th17优先浸润结肠固有层，通过阻断过继免疫模型中α4β7整合素途径可以特异性地阻断Th17的肠内归巢，从而缓解EAE疾病的严重程度［31］。DITTEL等［32］发现肾上腺皮质激素可通过减少肠道固有层中细胞因子IL-6的分泌，减少促炎性Th17的分化，增加Foxp3+Treg数量，从而减轻EAE小鼠临床症状评分，阻止疾病的进程。肠道内Th17的过度激活、Treg的缺失及抑制性功能的缺陷均可能参与EAE的发病，虽然其确切的作用机制尚未完全明确。

Th17细胞组成性地表达于回肠、结肠固有层［33］，其发育依赖于肠道内微生物群，同时，也是控制病原微生物所必需的，有助于维持肠道正常免疫功能，可动员和招募先天免疫细胞到病原体感染部位清除致病菌，而过度诱导的Th17则会导致肠道免疫功能紊乱，扩大肠道内免疫反应，从而引发自身免疫性疾病。肠道菌群有利于肠道黏膜免疫系统的发育和免疫调控，可通过直接或间接方式诱导和调节T细胞的增殖分化来维持肠道黏膜免疫的平衡，协调机体的免疫耐受［34-35］。肠道菌群的改变可通过发育致病性T细胞而参与MS的发生和发展［36］。Treg及其分泌的抑制性细胞因子IL-10和TGF-β在维持肠道免疫耐受方面发挥至关重要的作用，可以阻止异常的自身免疫反应发生［37-38］。Th17与Treg相互拮抗、制约，是维持正常的机体整体免疫功能和肠道免疫屏障功能中关键的因素，二者的失衡在MS/EAE发病机制中起着重要作用［39］，表明肠道内Th17、Treg淋巴细胞与EAE之间存在相关性，并参与了EAE疾病的进程。

本研究纳入的8篇文献研究对象样本量相对较少，纳入的动物实验在随机序列产生方法、盲法的使用等方法报告不充分，不能确定潜在偏倚风险。此外，动物实验重要的基线特征未阐明，随机分配在目前尚未成为动物实验的标准实践模式，各研究观察环境、啮齿类动物来源、肠道部位、肠道淋巴细胞、造模方式、疾病观察时间点等不同，均可能是造成结果偏倚的因素，因此本研究在进行资料合并时，存在结局指标异质性较大的问题。肠道免疫受多种因素的影响（饮食、药物、菌群等），且其变化在疾病的过程中呈动态发展，此外肠道不同部位免疫应答亦不相同。因此，未来仍需更多大样本以及高质量的随机对照试验来证明肠道菌群及肠道免疫系统在MS/EAE中扮演的确切角色，以期提供可靠的有价值的循证医学证据。

综上所述，本文系统地总结了MS动物模型EAE与肠道免疫微环境（包括肠道菌群，肠道内Th17、Treg淋巴细胞）之间的关系，发现二者密切相关。EAE模型鼠肠道菌群结构存在明显的改变，并伴有肠道免疫稳态（肠道Th17、Treg细胞）的变化。靶向肠道菌群和肠道免疫的治疗可能影响到MS/EAE的发生与发展，为多发性硬化的治疗提供新的思路与策略。